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Estudos estruturais e calorimétricos com a Importina-alfa do fungo Neurospora crassa e sequências de localização nuclear de fatores de transcrição.

Processo: 16/09314-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2016
Vigência (Término): 31 de julho de 2017
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Roberto de Mattos Fontes
Beneficiário:
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/24705-3 - O fungo filamentoso Neurospora crassa como um organismo modelo para a caracterização funcional de proteínas/fatores de transcrição que regulam o metabolismo de carboidratos, AP.TEM
Assunto(s):Neurospora crassa

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesta via, proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-alfa/beta. A Importina-alfa (ImpA) contém o sítio de ligação do NLS, enquanto a Importina-beta (ImpB) media o transporte através do poro da membrana nuclear. O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (ImpANc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. Dentre os mecanismos responsáveis pelo regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-alfa/beta é um dos principais processos. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-alfa (ImpANc) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImpA apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) Expressão e purificação da proteína Importina-alfa de Neurospora crassa; b) quantificar a interação do peptídeos NLS da proteína hipotética NCU01629 (VPRPKRQQRRL) com a ImpANc por experimentos utilizando técnicas calorimétricas; c) cristalizar e elucidar a estrutura da Imp±Nc com o peptídeo (VPRPKRQQRRL) da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio. (AU)