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Resumo

A maioria dos acidentes ofídicos na América Latina são provocados por serpentes do gênero Bothrops, sendo uma de suas consequências, a necrose muscular, não neutralizada pela administração do soro antiofídico. Fosfolipases A2 homólogas (homPLA2s) são geralmente abundantes no veneno botrópico e uma das toxinas responsáveis pela necrose muscular. HomPLA2s são miotóxicas pela capacidade de perturbar membrana celular através de um mecanismo não catalítico não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela coexistência de diferentes isoformas. Cristais destas amostras podem conter espécies heterogêneas não totalmente caracterizadas. Abordaremos esta questão propondo um algoritmo, chamado de SEQUENCE SLIDER (SLIDER), que avalie diferentes possibilidades de sequências contra dados cristalográficos. Calibraremos este algoritmo com os dados disponíveis de homPLA2s no banco de dados e o aplicaremos a elucidação de estruturas desconhecidas. Ademais, o cenário de incerteza da sequência é imediatamente aplicável ao programa de faseamento ARCIMBOLDO ao tratar dados de resolução mais baixa que o seu escopo usual de 2,0 Å. Desenvolveremos SLIDER para aumentar os modelos parciais do ARCIMBOLDO, comumente compostos de polialanina, incorporando cadeias laterais e estendendo este método de faseamento a mais baixas resoluções. Por outro lado, avaliando as estruturas cristalográficas de homPLA2s, relacionaremos sua flexibilidade oligomérica ao seu mecanismo ação, visto que sua configuração dimérica e seus resíduos expostos são essenciais à miotoxicidade. Avaliaremos também esta flexibilidade através de análises de Modos Normais de baixa frequência, já que estes podem descrever movimentos reais relacionados com propriedades biológicas fundamentais. Para tanto, estabeleceremos a relação entre a exposição destes resíduos importantes, o movimento natural entre monômeros e o rompimento da membrana. Desta forma, os objetivos deste projeto são de desenvolver e implementar um novo algoritmo que auxilie na elucidação de estrutura de toxinas e de relacionar mecanismo de ação de homPLA2s à sua flexibilidade estrutural. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). A estrutura da proteína Imp± já foi elucidada e caracterizada em alguns organismos. Através da análise das sequências de aminoácidos dessas proteínas, foi possível classificá-las em três subfamílias: ±1, ±2, e ±3. As diferenças entre as proteínas Imp± de cada família evidenciam as especificidades destas no reconhecimento de NLSs, dependendo do organismo e função que exercem. Ou seja, um mesmo peptídeo NLS pode apresentar variações na afinidade e no modo de ligação quando interage com Imp± de famílias distintas. O objetivo desse projeto é comparar a afinidade e o modo de ligação de um mesmo peptídeo NLS com proteínas Imp± das famílias ±1 e ±2. Os NLSs utilizados nesse projeto serão de fatores de transcrição do fungo Neurospora crassa e os resultados desse estudo poderão contribuir com a identificação de especificidades dos NLSs na interação com a Imp± de Neurospora crassa. Inicialmente, serão analisadas as afinidades das interações de um mesmo peptídeo NLS de fungo com as Imp± de Neurospora crassa (família ±1) e de Mus Musculus (família ±2). Em seguida, os complexos Imp±Nc/peptídeos NLS e Imp±Mm/peptídeos NLS serão testados por experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e comparadas para verificar especificidades a nível estrutural, na interação de um mesmo peptídeo NLS com Imp± de diferentes famílias. O laboratório Biofísica Molecular Estrutural do Instituto de Biociências de Botucatu, conta com a infra-estrutura necessária e pessoal capacitado para a realização de todos os experimentos descritos no projeto. O presente projeto está vinculado a Projeto Temático da FAPESP vigente (proc. 2013/24705-3). (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e foi recentemente incluído na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. No Brasil registra-se mais de vinte mil acidentes ofídicos por ano, sendo que aproximadamente 90% dos acidentes envolvem serpentes do gênero Bothrops. Os acidentes botrópicos ocasionam alterações locais como dor, edema, equimoses e intensa mionecrose. O único tratamento disponível é a soroterapia, porém, ela não é totalmente eficaz na recuperação dos danos locais, podendo não evitar a amputação de membros e a consequente desabilitação da vítima. O objetivo deste projeto é estudar por técnicas de cristalografia de proteínas a interação entre fosfolipases A2-like (PLA2s) que, juntamente com as metaloproteases, são as principais responsáveis pelo quadro de mionecrose na maioria das serpentes botrópicas. Sendo assim, propõe-se a co-cristalização da bothropstoxina-I (BthTX-I), uma Lys49-PLA2 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, e possíveis inibidores vegetais, tais como ácido cinâmico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido clorogênico, ácido caftárico e ácido chicórico visando a obtenção de inibidor miotóxico. Este estudo é parte de uma linha de pesquisa do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural nos últimos 15 anos, sendo publicados cerca de 50 artigos que foram intensamente citados pela comunidade científica internacional. Atualmente, nosso grupo há dois pós-doutorandos bolsistas da FAPESP, cinco doutorandos e um mestrando nesta linha de pesquisa que vem sendo apoiada constantemente por projetos da FAPESP, CNPq e CAPES. (AU)

Resumo

A crotoxina é um complexo heterodimérico que contém uma fosfolipase A2 e é a principal responsável pelo pronunciado efeito neurotóxico do veneno das serpentes da espécie Crotalus durissus, popularmente conhecida como cascavéis, por conta de sua potente atividade de bloqueio da transmissão neuromuscular. A crotoxina é formada por duas subunidades, uma ácida, não tóxica e desprovida de ação enzimática; conhecida como crotoxina A (CA) ou crotapotina; e uma básica, tóxica com atividade enzimática; conhecida como crotoxina B (CB). Crotalus neutralization factor (CNF) é um inibidor endógenos de fosfolipases A2 isolado do plasma sanguíneo de Crotalus durissus terrificus que se ligaria unicamente à crotoxina B e funcionaria como autoproteção dessas serpentes contra o próprio veneno. Este projeto de pesquisa propõe o estudo estrutural e funcional da crotoxina, de suas subunidades isoladas (CA e CB) e do CNF, através de técnicas de cristalografia de raios-X, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), espectroscopia de fluorescência e experimentos de mutação sítio dirigida. Experimentos em solução (SAXS e fluorescência) e de mutação sítio dirigida nunca antes foram realizados com a crotoxina e devem gerar relevantes informações a respeito do mecanismo de ação da crotoxina B e se desenvolver mecanismos para a sua inibição. Neste projeto, o candidato pretende se aprofundar no conhecimento de técnicas de biológica molecular estrutural com a proteína em solução (SAXS, fluorescência), já que em seu mestrado e doutorado obteve experiência na técnica de cristalografia de proteínas. Além disso, o projeto também propõe a inserção do candidato em estudos funcionais da crotoxina B através de experimentos de mutação sítio dirigida com posterior validação por experimentos in vitro. Dessa maneira, o candidato pretende ganhar maior aprofundamento das técnicas de biologia molecular estrutural e assim maior autonomia para a elaboração e execução de projetos de pesquisa. Em seu mestrado e doutorado, o candidato foi bolsista FAPESP com ótimo rendimento científico-acadêmico, com a publicação de 14 trabalhos, um que foi recentemente submetido à publicação e mais dois que se encontram em preparação. (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e foi recentemente incluído na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. Na América Latina, a grande maioria dos acidentes é causada por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Um dos principais problemas associados ao envenenamento botrópico é o proeminente dano local causado pela picada destas serpentes, sendo que as fosfolipases A2 e as metaloproteases são os seus principais constituintes. Neste projeto, nós propomos que o aluno trabalhe com fosfolipases A2 (PLA2s) e fosfolipases A2 homólogas (Lys49-PLA2s) do veneno de uma serpente amazônica (Bothrops brazili) pouco estudada funcionalmente e estruturalmente, desde que a maioria dos estudos é feitos com serpentes originárias da mata atlântica ou cerrado. O estudo estrutural com proteínas deste veneno foi iniciado a cerca de dois anos em nosso laboratório e permitiu a cristalização de três PLA2s com atividade miotóxicas (duas Lys49-PLA2s e uma PLA2) com a publicação de uma artigo no periódico Acta Crustallogaphica no segundo semestre do ano passado no qual o aluno é coautor. No projeto que estamos submetendo à FAPESP estamos propondo o término do refinamento/modelagem e análise estrutural das duas Lys49-PLA2s (MT-II e BbTX-II) com posterior redação de artigo científico. O aluno deverá atuar também na otimização dos cristais, coleta de dados de difração de raios X, refinamento/modelagem e análise estrutural da PLA2 miotóxica e catalítica (BbTX-III). O aluno selecionado para desenvolver o projeto atua no Laboratório de Biologia Molecular Estrutura (LBME) desde o primeiro semestre do seu curso de graduação e já usufrui bolsa PIBIC-CNPq que encerrará em julho/2013, além disso, ele vem apresentando ótimo desempenho acadêmico no curso de Física Médica, sendo um dos melhores alunos de sua turma. O projeto permite uma inserção do aluno em todas as técnicas da cristalografia de proteínas (cristalização, elucidação, modelagem, refinamento, análise estrutural e redação de artigo científico) o que poderá qualificá-lo plenamente para atuar na área que é carente de mão de obra qualificada em termos nacionais. (AU)

Resumo

A maioria dos acidentes ofídicos no Brasil são provocados por serpentes do gênero Bothrops, sendo uma de suas consequências, a necrose muscular, não contornada pela administração do soro antiofídico. O maior constituinte protéico do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular são as fosfolipases A2 miotóxicas (PLA2s). Estas podem ser divididas em: PLA2s ou Asp49-PLA2s, cujo mecanismo miotóxico no envenenamento é relacionado com o processo catalítico; e PLA2s homólogas ou Lys49-PLA2s, cuja estrutura terciária são semelhantes com as PLA2s, porém o mecanismo miotóxico não é relacionado com a catálise e não é totalmente conhecido. Por outro lado, algumas Asp49-PLA2s básicas compartilham a característica de as PLA2 homólogas exercerem a miotoxicidade independente da catálise. O objetivo deste projeto é entender esse mecanismo, o miotóxico independente da catálise, pelo estudo estrutural das miotoxinas botrópicas BthTX-II e PrTX-III (duas Asp-PLA2s básicas) e BthTX-I (PLA2 homóloga) em estado nativo e complexada com inibidores. Para tanto, realizaremos estudos estruturais (cristalografia e espalhamento de raios X a baixo ângulo) e teóricos (dinâmica molecular através de modos normais). Além disso, utilizaremos os modelos e os dados gerados para aumentar o alcance do novo método cristalográfico ab initio ARCIMBOLDO. Dessa forma, iremos testá-lo e otimizá-lo para explorar diferentes modelos provenientes da dinâmica molecular e unidades estruturais diferentes dos elementos de estrutura secundária já empregados. Em resumo, os resultados deste projeto auxiliarão a compreensão do mecanismo miotóxico e a complementação do soro antiófidico com os estudos com inibidores, ou posteriormente com desenho de fármacos, e otimizarão o método ab initio para outras determinações cristalográficas. (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e foi recentemente incluído na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. Na América Latina, a grande maioria dos acidentes é causada por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Um dos principais problemas associados ao envenenamento botrópico é o proeminente dano local causado pela picada destas serpentes, sendo que as fosfolipases A2 e as metaloproteases são os seus principais constituintes. Neste trabalho, nós propomos pela primeira vez um amplo estudo para caracterização estrutural e funcional de proteínas de veneno de serpentes nativas, recombinantes e complexadas com potenciais agentes inibidores. Dentre as técnicas a serem utilizadas destacamos: cristalografia de raios X, espalhamento de raios X a baixo ângulo, dicroísmo circular, espalhamento dinâmico de luz, experimentos de afinidade (proteína-inibidor utilizando a técnica de calorimetria de titulação isotérmica), cromatografia analítica por exclusão de tamanho, mutação sítio-dirigida, docking, dinâmica molecular, análise filogenética e estudos funcionais in vitro envolvendo técnicas miográficas e eletrofisiologicas seguidos de análises morfológicas (microscopia ótica e microscopia eletrônica). A aquisição destas informações poderá ser de grande valia para a identificação, caracterização e desenvolvimento (drug design) de compostos com grande potencial de uso biotecnológico e farmacológico. Estes compostos poderiam ser utilizados para o controle de sintomas não eficientemente neutralizados pela soroterapia convencional e, também, no combate a diversos processos patológicos (coagulopatias, doenças inflamatórias degenerativas e auto-imunes, mal de Alzheimer, esquizofrenia, infecções virais, asma, câncer, entre outras) cujas etiologias estão relacionadas a moléculas pertencentes aos mesmos grupos de proteínas onde se encontram classificadas as toxinas botrópicas e crotálicas que serão estudadas. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas pelo envoltório nuclear (Lange et al., 2007; Stewart, 2007). Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a importina-alfa atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX (Galagan, 2003). O estudo das proteínas do fungo Neurospora crassa visa atribuir funções biológicas as proteínas hipotéticas relacionadas a esse metabolismo. Nesse contexto, a importina-alfa aparece como modelo para testar a função dessas proteínas hipotéticas e o presente projeto tem por objetivo a obtenção da estrutura da proteína através de estudos cristalográficos. Considerando os estudos já realizados com essa proteína onde não se conseguiu cristais convenientes para difração de raios X até o momento, serão conduzidos também experimentos de cristalização da proteína com peptídeos NLS, entre eles o peptídeo NLS SV40 e da proteína NCU03482. Como demonstrado recentemente por nós (Takeda et al 2012), a formação de complexos com a importina-± confere estabilidade a mesma. Os estudos propostos neste projeto serão conduzidos em colaboração com a Profª Maria Célia Bertolini do Instituto de Química da UNESP - campus de Araraquara. O projeto é diretamente relacionado com os projetos (SMOLBNET 2) - proc. 2010/51889-0 e o projeto temático proc. 08/57566-8. (AU)

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