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Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína Importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). A estrutura da proteína Imp± já foi elucidada e caracterizada em alguns organismos. Através da análise das sequências de aminoácidos dessas proteínas, foi possível classificá-las em três subfamílias: ±1, ±2, e ±3. As diferenças entre as proteínas Imp± de cada família evidenciam as especificidades destas no reconhecimento de NLSs, dependendo do organismo e função que exercem. Ou seja, um mesmo peptídeo NLS pode apresentar variações na afinidade e no modo de ligação quando interage com Imp± de famílias distintas. O objetivo desse projeto é comparar a afinidade e o modo de ligação de um mesmo peptídeo NLS com proteínas Imp± das famílias ±1 e ±2. Os NLSs que serão utilizados nesse projeto são de fatores de transcrição do fungo Neurospora crassa e os resultados desse estudo poderão contribuir com a identificação de especificidades dos NLSs na interação com a Imp± de N. crassa (NcImp±). Inicialmente, serão analisadas as afinidades das interações de um mesmo peptídeo NLS de fungo com as NcImp± (família ±1) e a Imp± de Mus Musculus (MmImp±-família ±2). Em seguida, os complexos NcImp±/peptídeos NLS e MmImp±/peptídeos NLS serão submetidos a experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e comparadas para verificar especificidades, a nível estrutural, na interação de um mesmo peptídeo NLS com Imp± de diferentes famílias. Adicionalmente, visando quantificar as interações entre estes peptídeos NLS e as MmImp± e NcImp±, serão realizados experimentos de calorimetria de por titulação isotérmica (ITC) que pode fornecer a constante de dissociação, estequiometria, entalpia e entropia das interações. O presente projeto está vinculado a Projeto Temático (proc.2013/24705-3). (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesta via, proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-alfa/beta. A Importina-alfa (ImpA) contém o sítio de ligação do NLS, enquanto a Importina-beta (ImpB) media o transporte através do poro da membrana nuclear. O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (ImpANc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. Dentre os mecanismos responsáveis pelo regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-alfa/beta é um dos principais processos. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-alfa (ImpANc) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImpA apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) Expressão e purificação da proteína Importina-alfa de Neurospora crassa; b) quantificar a interação do peptídeos NLS da proteína hipotética NCU01629 (VPRPKRQQRRL) com a ImpANc por experimentos utilizando técnicas calorimétricas; c) cristalizar e elucidar a estrutura da Imp±Nc com o peptídeo (VPRPKRQQRRL) da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína Importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (Imp±Nc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. O objetivo desse projeto é identificar as especificidades da proteína Imp±Nc através da caracterização da interação na proteína com NLSs específicos de fungos, além da comparação da funcionalidade desses NLSs na importação nuclear junto a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. Iniciamente, serão analisadas as afinidades das interações da Imp±Nc junto a potenciais NLSs identificados. Em seguida, os complexos Imp±Nc/peptídeos NLS serão submetidos a experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e analisadas. Paralelamente, serão realizados ensaios de importação nuclear in vitro para verificar a funcionalidades dos NLSs analisados na interação com a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. O laboratório do Prof. Marcos R.M. Fontes, no Instituto de Biociências de Botucatu, conta com a infra-estrutura necessária para a realização de todos os experimentos descritos no projeto, exceto os ensaios funcionais que deverão ser realizados em colaboração com um grupo internacional. A candidata foi bolsista de iniciação científica pela Fapesp (proc.: 2011/22043-8) e, atualmente é bolsista de mestrado (proc.: 2012/16371-5). O presento projeto está vinculado a Projeto Temático recentemente aprovado (proc. 2013/24705-3). (AU)

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