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Resumo

A maioria dos acidentes ofídicos na América Latina são provocados por serpentes do gênero Bothrops, sendo uma de suas consequências, a necrose muscular, não neutralizada pela administração do soro antiofídico. Fosfolipases A2 homólogas (homPLA2s) são geralmente abundantes no veneno botrópico e uma das toxinas responsáveis pela necrose muscular. HomPLA2s são miotóxicas pela capacidade de perturbar membrana celular através de um mecanismo não catalítico não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela coexistência de diferentes isoformas. Cristais destas amostras podem conter espécies heterogêneas não totalmente caracterizadas. Abordaremos esta questão propondo um algoritmo, chamado de SEQUENCE SLIDER (SLIDER), que avalie diferentes possibilidades de sequências contra dados cristalográficos. Calibraremos este algoritmo com os dados disponíveis de homPLA2s no banco de dados e o aplicaremos a elucidação de estruturas desconhecidas. Ademais, o cenário de incerteza da sequência é imediatamente aplicável ao programa de faseamento ARCIMBOLDO ao tratar dados de resolução mais baixa que o seu escopo usual de 2,0 Å. Desenvolveremos SLIDER para aumentar os modelos parciais do ARCIMBOLDO, comumente compostos de polialanina, incorporando cadeias laterais e estendendo este método de faseamento a mais baixas resoluções. Por outro lado, avaliando as estruturas cristalográficas de homPLA2s, relacionaremos sua flexibilidade oligomérica ao seu mecanismo ação, visto que sua configuração dimérica e seus resíduos expostos são essenciais à miotoxicidade. Avaliaremos também esta flexibilidade através de análises de Modos Normais de baixa frequência, já que estes podem descrever movimentos reais relacionados com propriedades biológicas fundamentais. Para tanto, estabeleceremos a relação entre a exposição destes resíduos importantes, o movimento natural entre monômeros e o rompimento da membrana. Desta forma, os objetivos deste projeto são de desenvolver e implementar um novo algoritmo que auxilie na elucidação de estrutura de toxinas e de relacionar mecanismo de ação de homPLA2s à sua flexibilidade estrutural. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesta via, proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-alfa/beta. A Importina-alfa (ImpA) contém o sítio de ligação do NLS, enquanto a Importina-beta (ImpB) media o transporte através do poro da membrana nuclear. O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (ImpANc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. Dentre os mecanismos responsáveis pelo regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-alfa/beta é um dos principais processos. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-alfa (ImpANc) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImpA apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) Expressão e purificação da proteína Importina-alfa de Neurospora crassa; b) quantificar a interação do peptídeos NLS da proteína hipotética NCU01629 (VPRPKRQQRRL) com a ImpANc por experimentos utilizando técnicas calorimétricas; c) cristalizar e elucidar a estrutura da Imp±Nc com o peptídeo (VPRPKRQQRRL) da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio. (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e está incluso na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. Na América Latina, destacam-se os acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops, já que este gênero é responsável por cerca de 85% dos acidentes reportados nesta região. Um dos principais problemas associados ao envenenamento botrópico é o proeminente dano local causado pela picada destas serpentes, sendo que podemos destacar algumas classes de proteínas merecem destaque neste cenário. Uma delas são as fosfolipases A2 (PLA2s) e PLA2s-homólogas, que atuam diretamente na membrana da célula muscular, causando lesão nas mesmas. Outro exemplo são metaloproteases (MPs), que atuam em diferentes componentes da membrana basal de vasos sanguíneos, causando hemorragia. Neste trabalho, propomos estudos biofísicos (calorimetria de titulação isotérmica, espalhamento de raios X a baixo ângulo e cristalografia de raios X) e funcionais com estas classes de proteínas, visto que as lesões causadas por elas não podem ser prevenidas ou revertidas pela administração do soro antiofídico. Realizaremos estudos estruturais com complexos formados entre toxinas das classes acima citadas e inibidores já conhecidos na literatura, tanto para as PLA2s-homólogas e metaloproteases de classes I e III, visando uma melhor compreensão das bases estruturais que levam à inibição destas toxinas. Baseado nisso, temos o intuito de identificar possíveis novos ligantes candidatos a inibidores de ambos os grupos de proteínas mostrados aqui, as quais causam a miotoxidade em acidentes botrópico. (AU)

Resumo

Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-± (Imp±) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImp± apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) cristalizar e elucidar a estrutura da NcImp± com peptídeos da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio; b) quantificar a interação dos peptídeos NLS com a NcImp± por experimentos utilizando técnicas de calorimétricas; c) expressar, purificar e caracterizar preliminarmente proteínas envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio da N. crassa. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína Importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (Imp±Nc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. O objetivo desse projeto é identificar as especificidades da proteína Imp±Nc através da caracterização da interação na proteína com NLSs específicos de fungos, além da comparação da funcionalidade desses NLSs na importação nuclear junto a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. Iniciamente, serão analisadas as afinidades das interações da Imp±Nc junto a potenciais NLSs identificados. Em seguida, os complexos Imp±Nc/peptídeos NLS serão submetidos a experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e analisadas. Paralelamente, serão realizados ensaios de importação nuclear in vitro para verificar a funcionalidades dos NLSs analisados na interação com a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. O laboratório do Prof. Marcos R.M. Fontes, no Instituto de Biociências de Botucatu, conta com a infra-estrutura necessária para a realização de todos os experimentos descritos no projeto, exceto os ensaios funcionais que deverão ser realizados em colaboração com um grupo internacional. A candidata foi bolsista de iniciação científica pela Fapesp (proc.: 2011/22043-8) e, atualmente é bolsista de mestrado (proc.: 2012/16371-5). O presento projeto está vinculado a Projeto Temático recentemente aprovado (proc. 2013/24705-3). (AU)

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