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Resumo

A maioria dos acidentes ofídicos na América Latina são provocados por serpentes do gênero Bothrops, sendo uma de suas consequências, a necrose muscular, não neutralizada pela administração do soro antiofídico. Fosfolipases A2 homólogas (homPLA2s) são geralmente abundantes no veneno botrópico e uma das toxinas responsáveis pela necrose muscular. HomPLA2s são miotóxicas pela capacidade de perturbar membrana celular através de um mecanismo não catalítico não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela coexistência de diferentes isoformas. Cristais destas amostras podem conter espécies heterogêneas não totalmente caracterizadas. Abordaremos esta questão propondo um algoritmo, chamado de SEQUENCE SLIDER (SLIDER), que avalie diferentes possibilidades de sequências contra dados cristalográficos. Calibraremos este algoritmo com os dados disponíveis de homPLA2s no banco de dados e o aplicaremos a elucidação de estruturas desconhecidas. Ademais, o cenário de incerteza da sequência é imediatamente aplicável ao programa de faseamento ARCIMBOLDO ao tratar dados de resolução mais baixa que o seu escopo usual de 2,0 Å. Desenvolveremos SLIDER para aumentar os modelos parciais do ARCIMBOLDO, comumente compostos de polialanina, incorporando cadeias laterais e estendendo este método de faseamento a mais baixas resoluções. Por outro lado, avaliando as estruturas cristalográficas de homPLA2s, relacionaremos sua flexibilidade oligomérica ao seu mecanismo ação, visto que sua configuração dimérica e seus resíduos expostos são essenciais à miotoxicidade. Avaliaremos também esta flexibilidade através de análises de Modos Normais de baixa frequência, já que estes podem descrever movimentos reais relacionados com propriedades biológicas fundamentais. Para tanto, estabeleceremos a relação entre a exposição destes resíduos importantes, o movimento natural entre monômeros e o rompimento da membrana. Desta forma, os objetivos deste projeto são de desenvolver e implementar um novo algoritmo que auxilie na elucidação de estrutura de toxinas e de relacionar mecanismo de ação de homPLA2s à sua flexibilidade estrutural. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesta via, proteínas que contém as clássicas sequências de localização nuclear (NLSs) são importadas para o núcleo pelo heterodímero importina-alfa/beta. A Importina-alfa (ImpA) contém o sítio de ligação do NLS, enquanto a Importina-beta (ImpB) media o transporte através do poro da membrana nuclear. O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (ImpANc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. Dentre os mecanismos responsáveis pelo regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-alfa/beta é um dos principais processos. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-alfa (ImpANc) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImpA apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) Expressão e purificação da proteína Importina-alfa de Neurospora crassa; b) quantificar a interação do peptídeos NLS da proteína hipotética NCU01629 (VPRPKRQQRRL) com a ImpANc por experimentos utilizando técnicas calorimétricas; c) cristalizar e elucidar a estrutura da Imp±Nc com o peptídeo (VPRPKRQQRRL) da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio. (AU)

Resumo

Envenenamento causado por serpentes é considerado um grave problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e foi recentemente incluído na lista de Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde. Na América Latina, a maioria dos acidentes ofídecos são causados por serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus. Uma das principais complicações em relação aos envenenamento botrópicos é o dano muscular local proeminente e subsequente bloqueio de transmissão neuromuscular, que é normalmente induzido pela fosfolipase A2, que é um importante componente destes venenos. Neste projeto, nós propomos, pela primeira vez, um estudo estrutural e funcional amplo de proteínas de veneno de serpentes - nativas, recombinantes e complexadas com potenciais inibidores. Serão utilizadas as seguintes técnicas: i) estrutural/biofísico: cristalografia, espalhamento de raios-X a baixos ângulos, dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, fluorescência e calorimetria por titulação isotérmica, bioinformática estrutural; ii) estudos in vitro funcionais, incluindo eletrofisiologia, técnicas miográficas, vídeo-microscopia em tempo real e estudos de radioquímicos; iii) análise morfológica (óptica, confocal e microscopia eletrônica). Estas informações podem ser muito importantes para a identificação, caracterização e desenvolvimento (drug design) de substâncias com utilidade biotecnológicas e farmacológicas. Estes compostos podem ser utilizados para o controle de sintomas que não podem ser prevenidos ou revertidos por administração terapêutica de soro anti-ofídico e como auxílio para o tratamento do processo patológico subjacente. Este projeto está alinhado com outros projectos anteriormente apoiados pela FAPESP (quatro na área de proteínas de veneno de serpentes) e CNPq (três projetos) desde 1997. Além disso, o laboratório brasileiro também foi apoiado pelo INCT em Toxinologia (FAPESP / CNPq) e projeto Toxinologia da CAPES. A produção científica do laboratório brasileiro na área de toxinas conta com cerca de 60 artigos e 16 dissertações/teses concluídas. Desde 1991, o Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia fazer, ICBAS-UPorto tem feito pesquisas pioneiras no estudo da patogenia dos déficits da transmissão neuromuscular, rotineiramente usando neuroquímicos, abordagens eletrofisiológicas e bioimagem necessárias para este projeto. Ambos grupos de pesquisa brasileirose portugues têm um projeto de colaboração que inclui um artigo publicado recentemente e uma bolsa de pós-doutorado da FAPESP (BEPE-FAPESP n ° 2013 / 03624-5). (AU)

Resumo

A colaboração do Prof. Bostjan Kobe conosco se iniciou durante o pós-doutoramento do Prof. Fontes na Universidade de Melbourne - Austrália em maio/1999. Desde então, o Prof. Fontes teve oportunidade de regressar ao seu laboratório na Austrália outras duas vezes, e o Prof Bostjan desenvolveu atividades em nosso laboratório em Botucatu outras duas vezes. Esta interação de longo prazo acarretou na publicação de 10 artigos científicos (há um décimo primeiro submetido), em periódicos como: Journal Biological Chemistry (3 artigos), Journal of Molecular Biology (3 artigos), Acta Crystal. D (2 artigos), Bioph. J. (1), BBA (1) artigos. Alguns destes artigos tiveram um grande número de citações (acima de 100). Além disso, este projeto está vinculado a orientação de alunos de mestrado (2), doutorado (3) e pós-doutorado (3) já concluídas ou em andamento. A atual visita do Prof Bostjan ocorrerá em um momento que estamos com uma intensa interação entre os dois grupos, com o aceite de um review no periódico Journal of Molecular Biology, submetemos outro artigo da estrutura da importina-alfa e a proteína relacionada a reparo de DNA, a proteína XPG, e estamos redigindo um outro artigo com a importina-alfa e a proteína relacionada a reparo de DNA MLH1/PMS2. Estamos pretendendo com a visita do Prof. Bostjan concluir a redação deste artigo e direcionar novos projetos a serem realizados em colaboração entre os dois grupos. Será também um importante momento de interação do Prof. Bostjan com os alunos do grupo e do Instituto, particularmente, com o grupo da Profa Dr. Maria Isabel Cano. Este grupo de pesquisadores publicou um artigo em colaboração conosco e tem interesse no estudo de importação de proteínas para o núcleo. Há também um interesse da Profa. Maria Isabel Bertolini (Coordenadora do Temático que estamos vinculados) na área e, provavelmente, a Profa. Bertolini. Pretendemos também oferecer uma disciplina de pós-graduação no qual o Prof. Bostjan ministrará algumas aulas. Por fim, submetemos a SBBq (Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular) a proposta de um Simpósio intitulado "Regulation of protein import to the nucleus" para o Congresso que ocorrerá no período de 18-21/junho de 2016. Esta proposta foi selecionada pela Diretoria da Sociedade e deverá contar com um Seminário do Prof. Bostjan. Esta atividade apesar de não ser apoiada pela FAPESP por se desenvolver fora do Estado de São Paulo, também será beneficiada com a vinda do Professor Visitante. (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e está incluso na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. Na América Latina, destacam-se os acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops, já que este gênero é responsável por cerca de 85% dos acidentes reportados nesta região. Um dos principais problemas associados ao envenenamento botrópico é o proeminente dano local causado pela picada destas serpentes, sendo que podemos destacar algumas classes de proteínas merecem destaque neste cenário. Uma delas são as fosfolipases A2 (PLA2s) e PLA2s-homólogas, que atuam diretamente na membrana da célula muscular, causando lesão nas mesmas. Outro exemplo são metaloproteases (MPs), que atuam em diferentes componentes da membrana basal de vasos sanguíneos, causando hemorragia. Neste trabalho, propomos estudos biofísicos (calorimetria de titulação isotérmica, espalhamento de raios X a baixo ângulo e cristalografia de raios X) e funcionais com estas classes de proteínas, visto que as lesões causadas por elas não podem ser prevenidas ou revertidas pela administração do soro antiofídico. Realizaremos estudos estruturais com complexos formados entre toxinas das classes acima citadas e inibidores já conhecidos na literatura, tanto para as PLA2s-homólogas e metaloproteases de classes I e III, visando uma melhor compreensão das bases estruturais que levam à inibição destas toxinas. Baseado nisso, temos o intuito de identificar possíveis novos ligantes candidatos a inibidores de ambos os grupos de proteínas mostrados aqui, as quais causam a miotoxidade em acidentes botrópico. (AU)

Resumo

Importina-alfa (Impa) é uma proteína que medeia a importação nuclear através do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLSs) na macromolécula que irá ser transportada. A superfície côncava da Impa contém resíduos conservados que formam os dois sítios conhecidos como sítios de ligação a NLS, os sítios principal e secundário. Para entender melhor o reconhecimento de NLSs e obter informações sobre o processo de importação nuclear em fungos, a primeira estrutura cristalográfica da Impa de um fungo filamentoso (Neurospora crassa; NcImpa), complexado com uma NLS clássica, foi elucidada pelo nosso grupo. Agora, o foco desse projeto é o estudo das interações entre a NcImpa com potenciais NLSs de fungos, utilizando técnicas cristalográficas, termodinâmicas e experimentos funcionais. O fungo N. crassa é amplamente usado como um organismo modelo para compreender a regulação de processos celulares básicos, tais como o metabolismo do glicogênio. Foram identificados muitas proteínas e fatores de transcrição que, provavelmente, desempenham um papel nestes processos. Alguns destes fatores de transcrição e proteínas possuem sequências de localização nuclear, sugerindo que eles podem ser transportadas para o núcleo através da via clássica de importação nuclear, que é mediada por Importinas. A análise destes potenciais NLSs por calorimetria de titulação isotérmica mostrou uma afinidade elevada com a NcImpa. O objetivo deste projeto é verificar a funcionalidade destes NLSs de fungos filamentosos a serem transportados para o núcleo pela Impa e para identificar alterações no seu transporte, adicionando NLS mutados ou um inibidor de NLSs. Para isso, estes NLSs promissores serão submetidos a estudos in vivo com células HeLa permeabilizadas com digitonina para observar a importação nuclear destes peptídeos, sob condições biológicas. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). A estrutura da proteína Imp± já foi elucidada e caracterizada em alguns organismos. Através da análise das sequências de aminoácidos dessas proteínas, foi possível classificá-las em três subfamílias: ±1, ±2, e ±3. As diferenças entre as proteínas Imp± de cada família evidenciam as especificidades destas no reconhecimento de NLSs, dependendo do organismo e função que exercem. Ou seja, um mesmo peptídeo NLS pode apresentar variações na afinidade e no modo de ligação quando interage com Imp± de famílias distintas. O objetivo desse projeto é comparar a afinidade e o modo de ligação de um mesmo peptídeo NLS com proteínas Imp± das famílias ±1 e ±2. Os NLSs utilizados nesse projeto serão de fatores de transcrição do fungo Neurospora crassa e os resultados desse estudo poderão contribuir com a identificação de especificidades dos NLSs na interação com a Imp± de Neurospora crassa. Inicialmente, serão analisadas as afinidades das interações de um mesmo peptídeo NLS de fungo com as Imp± de Neurospora crassa (família ±1) e de Mus Musculus (família ±2). Em seguida, os complexos Imp±Nc/peptídeos NLS e Imp±Mm/peptídeos NLS serão testados por experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e comparadas para verificar especificidades a nível estrutural, na interação de um mesmo peptídeo NLS com Imp± de diferentes famílias. O laboratório Biofísica Molecular Estrutural do Instituto de Biociências de Botucatu, conta com a infra-estrutura necessária e pessoal capacitado para a realização de todos os experimentos descritos no projeto. O presente projeto está vinculado a Projeto Temático da FAPESP vigente (proc. 2013/24705-3). (AU)

Resumo

Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nesse processo, o estudo estrutural da Importina-± (Imp±) é uma peça chave para o seu entendimento. Assim, esta proteína foi recentemente cristalizada e teve sua estrutura elucidada pelo nosso grupo de pesquisa. Experimentos biofísicos também já foram realizados por nós e mostraram que a proteína conserva algumas características presentes nas isoformas de Mus musculus e Saccharomyces cerevisiae que já tiveram suas estruturas cristalográficas elucidadas. Porém, a NcImp± apresenta aminoácidos não conservados próximos a região do domínio IBB, o que pode estar relacionado com a especificidade da proteína. Então, estamos propondo neste projeto: a) cristalizar e elucidar a estrutura da NcImp± com peptídeos da região ligadora de proteína (região NLS) envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio; b) quantificar a interação dos peptídeos NLS com a NcImp± por experimentos utilizando técnicas de calorimétricas; c) expressar, purificar e caracterizar preliminarmente proteínas envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio da N. crassa. (AU)

Resumo

O envenenamento ofídico é um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais e foi recentemente incluído na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas pela Organização Mundial da Saúde. No Brasil registra-se mais de vinte mil acidentes ofídicos por ano, sendo que aproximadamente 90% dos acidentes envolvem serpentes do gênero Bothrops. Os acidentes botrópicos ocasionam alterações locais como dor, edema, equimoses e intensa mionecrose. O único tratamento disponível é a soroterapia, porém, ela não é totalmente eficaz na recuperação dos danos locais, podendo não evitar a amputação de membros e a consequente desabilitação da vítima. O objetivo deste projeto é estudar por técnicas de cristalografia de proteínas a interação entre fosfolipases A2-like (PLA2s) que, juntamente com as metaloproteases, são as principais responsáveis pelo quadro de mionecrose na maioria das serpentes botrópicas. Sendo assim, propõe-se a co-cristalização da bothropstoxina-I (BthTX-I), uma Lys49-PLA2 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, e possíveis inibidores vegetais, tais como ácido cinâmico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido clorogênico, ácido caftárico e ácido chicórico visando a obtenção de inibidor miotóxico. Este estudo é parte de uma linha de pesquisa do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural nos últimos 15 anos, sendo publicados cerca de 50 artigos que foram intensamente citados pela comunidade científica internacional. Atualmente, nosso grupo há dois pós-doutorandos bolsistas da FAPESP, cinco doutorandos e um mestrando nesta linha de pesquisa que vem sendo apoiada constantemente por projetos da FAPESP, CNPq e CAPES. (AU)

Resumo

A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Dentre as vias de transporte conhecidas que viabilizam o transporte de macromoléculas para dentro ou fora do núcleo, através do reconhecimento de sequências de sinalização específicas, a chamada Via Clássica de Importação Nuclear é a mais bem caracterizada. Nessa via, a proteína Importina-± (Imp±) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). O fungo filamentoso Neurospora crassa é amplamente utilizado em estudos bioquímicos e de biologia molecular, desde o início do século XX. Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Imp± de Neurospora crassa (Imp±Nc) bem como da sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína no reconhecimento de NLSs. Foram reconhecidos NLSs em proteínas relacionadas ao metabolismo de glicogênio e resposta a variações de luz em fungos. O objetivo desse projeto é identificar as especificidades da proteína Imp±Nc através da caracterização da interação na proteína com NLSs específicos de fungos, além da comparação da funcionalidade desses NLSs na importação nuclear junto a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. Iniciamente, serão analisadas as afinidades das interações da Imp±Nc junto a potenciais NLSs identificados. Em seguida, os complexos Imp±Nc/peptídeos NLS serão submetidos a experimentos de cristalização e os melhores cristais submetidos a difração de raios-X, coleta e processamento dos dados. Após etapas de modelagem e refinamento, as estruturas dos complexos serão elucidadas e analisadas. Paralelamente, serão realizados ensaios de importação nuclear in vitro para verificar a funcionalidades dos NLSs analisados na interação com a Imp±Nc e Imp± de outros organismos. O laboratório do Prof. Marcos R.M. Fontes, no Instituto de Biociências de Botucatu, conta com a infra-estrutura necessária para a realização de todos os experimentos descritos no projeto, exceto os ensaios funcionais que deverão ser realizados em colaboração com um grupo internacional. A candidata foi bolsista de iniciação científica pela Fapesp (proc.: 2011/22043-8) e, atualmente é bolsista de mestrado (proc.: 2012/16371-5). O presento projeto está vinculado a Projeto Temático recentemente aprovado (proc. 2013/24705-3). (AU)

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