Role of oxygen reactive species and ceramides in human neutrophil death induced by fatty acids

• Grant number: 10/50848-8
• Support Opportunities: Research Grants - Young Investigators Grants
• Start date: May 01, 2011
• End date: April 30, 2016
• Field of knowledge: Biological Sciences - Physiology
• Principal Investigator: Adriana Cristina Levada-Pires
• Grantee: Adriana Cristina Levada-Pires
• Host Institution: Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL). São Paulo , SP, Brazil
• City of the host institution: São Paulo
• Associated scholarship(s): 15/07815-5 - Signaling pathways involved in induction of neutrophil apoptosis by oleic and linoleic acids., BP.IC; 12/15079-9 - Reticulum stress involvement in fatty acids-induced neutrophils death., BP.IC; 11/10627-5 - Role of oxygen reactive species and ceramides in human neutrophil death induced by fatty acids, BP.JP

Abstract

Neste projeto, estudaremos o efeito dos ácidos graxos na geração de ROS e ceramidas e o possível papel destes segundos mensageiros na ativação de proteínas relacionadas com a apoptose de neutrófilos. Será avaliado o efeito dos seguintes AG: ácidos graxos saturados palmítico e esteárico e o monoinsaturado oleico que são os mais abundantes na circulação, o ácido graxo poliinsaturado n-6 linoléico, que é o principal constituinte do óleo de soja e, portanto, muito abundante na dieta, e os ácidos graxos poliinsaturados n-3 eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA), os principais constituintes dos óleos de peixe que têm enorme aplicação terapêutica. Neutrófilos humanos serão previamente tratados com concentração não tóxica 100 µM e tóxica 200 µM do ácido esteárico; 250 µM dos ácidos oleico, linoleico, palmítico e DHA e 500 µM do ácido EPA. Estas concentrações são tóxicas para neutrófilos após 3 horas de incubação. Para verificar o tipo de morte (apoptose ou piroptose) serão avaliados através de citometria de fluxo os seguintes parâmetros: viabilidade, fragmentação de DNA, polaridade de membrana mitocondrial, externalização de fosfatidilserina e atividade da caspase 1. Os mecanismos envolvidos no processo de morte dos neutrófilos induzido por AG, serão avaliados, por western blotting e por PCR em tempo real. O efeito destes sobre a expressão das proteínas pró e antiapoptóticas (Bcl-xL, Bax e Bim) e sobre as vias de indução da morte extrínseca (caspase 8 e Bid) e intrínseca com participação da mitocôndria (citocromo c, Smac/Diablo, caspase 9 e caspase 3) e/ou estresse de retículo endoplasmático (CHOP, GRP78, PERK, pPERK, peIF2α e caspase 12) também será determinado. O efeito dos AG sobre a produção de ROS será avaliado por quimioluminescência utilizando lucigenina e Amplex™ red. A geração de ceramidas será analisada em HPLC com detector ELSD - (Evaporative Light Scattering Detector). A possível participação das ROS e ceramidas no processo de indução de apoptose pelos ácidos graxos será avaliada por citometria de fluxo na presença de antioxidantes (desferrioxamina e N- Acetilcisteina - NAC), e/ou na presença de inibidores da geração de ceramidas (Fumonisina B2, 3-0-metilesfingomielina e fantofarona). Esta parte do estudo também será estudada pela utilização de camundongos Knockout para gp91phox -/- e esfingomielinase -/-. Serão avaliados os seguintes parâmetros de morte celular por citometria de fluxo: viabilidade, fragmentação de DNA, externalização de fosfatidilserina e despolarização de membrana mitocondriaI. Neste estudo, também será avaliado o efeito de concentrações tóxicas de AG sobre a fosforilação das proteínas MAP quinases (p38 MAP-quinase, ERK 1/2 e JNK); o mesmo será feito na presença de agentes antioxidantes e inibi dores da síntese de ceramidas. (AU)