Implementation of a method for evaluating gene editing efficiency

• Grant number: 25/05104-6
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Technical Training Program - Technical Training
• Start date: May 01, 2025
• End date: September 30, 2025
• Field of knowledge: Biological Sciences - Genetics - Molecular Genetics and Genetics of Microorganisms
• Principal Investigator: Monica Valdyrce dos Anjos Lopes Ferreira
• Grantee: Geonildo Rodrigo Disner
• Host Institution: Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brazil
• Associated research grant: 13/07467-1 - CeTICS - Center of Toxins, Immune-Response and Cell Signaling, AP.CEPID

Abstract

A edição gênica é uma ferramenta revolucionária que permite a modificação precisa de sequências de DNA em organismos vivos, com aplicações que vão desde a pesquisa básica até o desenvolvimento de terapias genéticas. A tecnologia CRISPR/Cas9, um dos métodos mais populares, utiliza um RNA guia para direcionar a nuclease Cas9 a uma sequência específica no genoma, promovendo cortes de fita dupla (DSBs). Esses cortes são reparados pelas vias celulares de recombinação não-homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga (HDR), podendo resultar em mutações insercionais ou delecionais (indels) que inativam genes ou introduzem modificações desejadas.Neste contexto, o zebrafish (Danio rerio) emergiu como um modelo altamente relevante para experimentos de edição gênica devido à combinação de características biológicas e técnicas que o tornam ideal para estudos funcionais de genes. Com um genoma completamente sequenciado e uma grande homologia com o genoma humano (cerca de 70% dos genes humanos têm homologia no zebrafish), esse modelo oferece uma base sólida para a investigação de mecanismos genéticos conservados. A facilidade de manipulação genética do zebrafish é uma de suas maiores vantagens. O desenvolvimento externo de seus embriões, associado à sua transparência durante os estágios iniciais, permite observação direta de processos biológicos em tempo real. Além disso, técnicas de microinjeção de CRISPR/Cas9 no estágio unicelular garantem uma introdução eficiente de mutações direcionadas, possibilitando estudos de perda e ganho de função com alta precisão.Apesar do potencial das abordagens de edição gênica em zebrafish, a validação da eficácia dos sistemas de edição é crucial para confirmar se o gene alvo foi modificado como planejado. Métodos como PCR e sequenciamento de nova geração (NGS) são frequentemente utilizados para essa análise, mas o sequenciamento pode ser inviável devido ao alto custo e necessidade de equipamentos especializados. Nesse contexto, o uso de alternativas acessíveis e robustas, como a análise com a enzima T7 Endonuclease I (T7E1), ganha destaque.O uso de T7 Endonuclease I em zebrafish é especialmente vantajoso para validar mutações introduzidas por edição gênica. Após a edição, a amplificação e análise da região-alvo permite verificar a eficiência da técnica, facilitando a seleção de linhagens geneticamente modificadas para estudos posteriores.A T7E1 é uma endonuclease que reconhece e cliva DNA heterodúplex formado por cadeias complementares com pares de bases incompatíveis ou distorções estruturais. Após a edição gênica, o DNA amplificado da região de interesse é desnaturado e renaturado para formar heterodúplex contendo as mutações introduzidas. A T7E1 cliva esses heterodúplex nos locais de incompatibilidade, gerando fragmentos que podem ser visualizados por eletroforese em gel. Essa metodologia permite avaliar a eficiência da edição ao estimar a proporção de DNA clivado.A importância dessa técnica está em sua acessibilidade e eficiência, tornando-a uma escolha popular em estudos de pesquisa inicial e triagem de amostras editadas. Além disso, a T7E1 pode ser utilizada para avaliar a especificidade da edição, identificando potenciais efeitos fora do alvo. Esses dados são essenciais para melhorar a precisão da edição gênica e mitigar riscos associados a aplicações clínicas. Com a validação por T7E1, pesquisadores podem otimizar condições experimentais, selecionar linhagens editadas com maior eficiência e avançar em estudos que dependem da modulação genética precisa. O uso dessa ferramenta ressalta a importância de métodos acessíveis e confiáveis no avanço da biotecnologia, promovendo o desenvolvimento de soluções inovadoras em saúde, agricultura e biologia molecular.