Estudo dos mecanismos moleculares associados à proteína SET com impacto na tumorigênese e progressão do câncer oral

Resumo

Este projeto visa à continuidade do estudo molecular e bioquímico da proteína SET na tumorigênese e na progressão e disseminação de tumores sólidos tendo como modelo/abordagem experimental o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HNSCC). A principal frente de investigação fundamenta-se no impacto desta proteína em vias de sinalização intracelular importantes para tumorigênese. Em nível molecular, os mecanismos de ação desta proteína no câncer oral ainda não são suficientemente compreendidos, embora várias funções tenham sido já descritas. Recentemente, nosso grupo mostrou o forte acúmulo da SET em amostras HNSCC, seu envolvimento na via de sinalização Akt em resposta ao estresse oxidativo e sua potencial função na resposta a danos no DNA. Além disto, no projeto anterior, obtivemos evidências de que o nível da SET na célula altera o nível de alguns miRNAs e RNAs de diversos fatores de transcrição alterados em câncer, fato este que sugere sua ação em controle de expressão. Obtivemos também evidências do seu envolvimento com invasão celular, diferenciação epitélio-mesenquimal e com resposta imune contra tumores xenoenxerto em camundongo nude a partir de linhagem HNSCC com a SET silenciada. Todos estes dados apontam para novas funções da proteína SET que podem contribuir para o câncer. Entretanto, os mecanismos moleculares relacionados com as ações descritas acima ainda não foram determinados, pois depende de mais estudos. Sendo assim, propomos neste projeto definir alguns dos mecanismos moleculares pelos quais a proteína SET contribui para a tumorigenese e a progressão do câncer oral. Para responder esta pergunta serão utilizadas linhagens celulares HNSCC (HNSCC: HN13, HN12, HN6, CAL-27), NOK-SI (queratinócito espontaneamente imortalizado) e a linhagem renal HEK293 (todas cedidas pelo Dr. J.Silvio Gutkind, NIH, EUA), após knockdown ou superexpressão da proteína de interesse. Estratégias de biologia celular e molecular e bioquímica serão empregadas no estudo funcional da proteína usando modelo in vitro e in vivo. Western blotting e imunofluorescência serão métodos utilizados para determinar o status (fosforilação e nível) das proteínas e distribuição na célula. Vários métodos e estratégias serão usados: RNA de interferência, sistemas de PCR array em tempo real, PCR em tempo real para miRNA, PCR, screening de quinases fosforiladas usando um sistema Antibody Array, interação proteína-proteina, ELISA, citometria de fluxo, proliferação celular, invasão, análise de metilação por PCR e PCR em tempo real, microscopia, formação de tumores xenoenxerto em camundongo nude, entre outros. Espera-se nesta proposta identificar os mecanismos moleculares associados a SET que favorecem o desenvolvimento e a progressão do câncer oral, com ênfase nas seguintes ações: instabilidade genômica, metilação de DNA, expressão de miRNAs, fosforilação de quinases, diferenciação epitélio-mesenquimal, resposta imune tumoral. A abordagem é multidisciplinar e permitirá ampliar o entendimento sobre as funções da SET no câncer oral. (AU)