Metilação da H3K9 como regulador da memória epigenética na reprogramação nuclear de bovinos.

Resumo

A persistência da memória epigenética somática é apontada como uma das principais barreiras para uma a reprogramação nuclear eficiente. Esta memória, entre outros aspectos da reprogramação e desenvolvimento embrionário, resulta que tecnologias como a transferência nuclear de células somática (TNCS) sejam ineficientes. A hipermetilação da H3K9 em núcleos somáticos tem sido indicada como uma das responsáveis pela persistência da memória epigenética. Entretanto, o entendimento desses mecanismos é escasso em bovinos. Baseado nisto, a hipótese desta proposta é que a diminuição dos níveis de metilação da H3K9 em fibroblastos fetais bovinos permite que genes importantes para o desenvolvimento sejam transcritos no momento da ativação do genoma embrionário de clones. Esta proposta será dividida em quatro fases: Na primeira fase identificaremos os genes relacionados à metilação da H3K9 utilizando ChIP-seq para H3K9me2 e H3K9me3. Na segunda fase, serão produzidos fibroblastos fetais (FFS) com enzimas de metiladoras de histonas silenciadas (G9a e Suv39h1) por siRNA. Na terceira fase, através de RNA-seq, analisaremos a influência da diminuição da H3K9 metilada na transição materno embrionária. Para isso, embriões no estágio de oito células serão produzidos utilizando os FFS (Bos taurus x Bos indicus) como doadores de núcleo na TNCS e analisados por RNA-seq comparados a embriões produzidos por fecundação in vitro (FIV) também Bos taurus x Bos indicus. Este cruzamento permitirá análise de genes com expressão alelo-específica, como os genes imprinted. Por último, os embriões no estágio de blastocisto serão analisados por diferentes colorações: coloração diferencial da massa celular interna e trofectoderma. Portanto, acreditamos que esse projeto nos permitirá compreender melhor o processo de formação da memória epigenética durante reprogramação celular para a utilização em futuras estratégias que visem a melhoria desta biotécnica. Sendo assim, esse projeto é de caráter inovador e servirá de base para o esclarecimento de importantes paradigmas envolvendo a clonagem e as técnicas de reprodução assistida.