Novas ferramentas para abordagens metagenômicas na prospecção de celulases

Resumo

A conversão de biomassa lignocelulósica em combustíveis renováveis tem sido considerada uma alternativa promissora para a substituição de combustíveis fósseis derivados de fontes de energia não-renováveis. A lignocelulose consiste principalmente de celulose, hemicelulose e lignina, sendo a celulose o material mais recalcitrante dentro das paredes celulares das plantas, mas com grande potencial como fonte de produção de bioetanol. Atualmente, há uma crescente demanda por enzimas com melhor desempenho catalítico e que sejam tolerantes a parâmetros específicos de processos industriais. Neste contexto, a metagenômica permite identificar biocatalisadores com atividades específicas sem a necessidade de isolamento e cultivo de microorganismos em laboratório. Por exemplo, triagens funcionais identificaram novas enzimas e várias outras moléculas advindas de inúmeros ambientes. No entanto, algumas barreiras têm limitado a descoberta de novos genes através de abordagens metagenômicas. A probabilidade de identificação de um determinado gene depende de múltiplos fatores que estão intrinsecamente ligados. A eficiência da expressão heteróloga de um gene advindo do DNA metagenômico em um organismo hospedeiro substituinte e a utilização de vetores de clonagem não-otimizados para a construção das bibliotecas metagenômicas geralmente resultam em uma baixa taxa de identificação de enzimas. Segundo estudos, apenas 40% das atividades enzimáticas podem ser recuperadas a partir da clonagem aleatória em Escherichia coli, a bactéria mais comumente utilizada em triagens funcionais metagenômicas. Visando contornar essas barreiras impostas à identificação de novas enzimas a partir de bibliotecas metagenômicas, o presente projeto propõe (i) a construção de bibliotecas metagenômicas em vetores de ampla faixa de hospedeiros (broad-host-range vectors) (pSEVA) e (ii) a construção de um vetor pCELsyn, derivado de um vetor pSEVA e que contém a endoglucanase Cel5A de Bacillus subtilis, para expressão simultânea da endoglucanase Cel5A e das possíveis enzimas codificadas nos fragmentos metagênomicos, que serão inseridos em sequência ao gene da Cel5A, buscando aumentar a probabilidade de identificação de enzimas com atividades celulásicas. Os screenings serão realizados em hospedeiros distintos: E. coli e Pseudomonas putida, buscando vantagens na utilização de um segundo hospedeiro para o screening funcional, como já descrito por alguns estudos. As bibliotecas serão construídas a partir de amostras de solo com matéria-prima em decomposição e os screenings funcionais buscarão por atividades celulásicas através de metodologias de screening já bem estabelecidas pela literatura. Dessa forma, espera-se obter aumento da possibilidade de identificação de atividades celulásicas positivas.