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Produção e caracterização de proteínas quiméricas contendo domínio catalítico quitinase e módulos para ligação em quitina

Processo: 18/06297-9
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de junho de 2018 - 31 de maio de 2020
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Orgânica
Pesquisador responsável:Dulce Helena Ferreira de Souza
Beneficiário:Dulce Helena Ferreira de Souza
Instituição-sede: Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia (CCET). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Assunto(s):Quitinases  Enzimas  Proteínas recombinantes 

Resumo

A quitina, polímero formado por monômeros de 5ý-1,4-N-acetilglucosamina e segundo biopolímero de maior ocorrência no planeta depois da celulose, é degradada por enzimas denominadas de quitinases (EC 3.2.2.14) que clivam a cadeia de quitina em sítios internos de maneira randômica. Essas enzimas são produzidas por uma grande variedade de organismos incluindo bactérias, fungos, insetos, plantas e animais e apresentam diferentes funções tais como nutrição, morfogênese e defesa contra patógenos. Para além da importante função biológica, quitinases têm sido usadas em biocontrole (com atividades fungicida, bactericida, inseticida). Em insetos as quitinases têm sido relacionadas com o remodelamento da quitina, presente no exoesqueleto e na matriz peritrófica. As quitinases de insetos têm sido classificadas em oito grupos distintos baseado, principalmente, na arquitetura de domínios como o catalítico e o CBM ('carbohydrate-binding module'). Em decorrência de estudos realizados no nosso grupo de pesquisa sobre a via se síntese de quitina e considerando a falta de infomação sobre quitinases de formigas cortadeiras propomos, neste projeto de pesquisa, a obtenção de diferentes proteínas quiméricas (contendo domínio catalítico quitinase e módulos para ligação em quitina) e o estudo de sua função catalítica frente à quitina e análise dos produtos através de HPLC e espectrometria de massas. Análise de sequências depositadas em bancos de dados já foi iniciada e dois pares de oligonucleotídeos foram adquiridos. RNA de A. sexdens será usado para obtenção de cDNA que será usado como molécula molde, em PCR, para amplificação dos DNA's. A expressão das proteínas será feita em P. pastoris, sistema bem estabelecido no nosso Laboratório. Também é objetivo do projeto avaliar se as proteínas apresentam potencial uso em biocontrole. Para desenvolver esses experimentos as proteínas serão testadas frente aos fungos fungos Aspergilus fumigatus e Candida albicans, importantes agentes infecciosos em humanos e frente a Spodoptera frugiperda, a principal praga da cultura do milho no Brasil. Para melhor entender a interação proteína-substrato (quitina) estudos serão realizados através da técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Espera-se, com este projeto, uma efetiva contribuição para a construção de módulos proteicos com atividades interessantes, como inseticida e fungicida. (AU)