Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmóci...
- Auxílios pontuais (curta duração)
| Processo: | 17/20745-1 |
| Linha de fomento: | Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores |
| Vigência: | 01 de novembro de 2018 - 31 de outubro de 2022 |
| Área do conhecimento: | Ciências da Saúde - Medicina |
| Pesquisador responsável: | Gerson Dierley Keppeke |
| Beneficiário: | Gerson Dierley Keppeke |
| Instituição-sede: | Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil |
| Pesq. associados: | Luiz Eduardo Coelho Andrade |
| Bolsa(s) vinculada(s): | 18/25444-2 - Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmócitos autorreativos, BP.JP |
| Assunto(s): | Edição de RNA Reumatologia Autoanticorpos Recombinação V(D)J CRISPR-Cas9 Plasmócitos |
Resumo
Autoanticorpos são marcadores de doenças autoimunes e em alguns casos estão diretamente envolvidos em sua fisiopatologia, tendo papel patogênico direto, como no caso da Miastenia Grave (MG), causada por anticorpos contra o receptor nicotínico de acetilcolina (anti-nAChR). A especificidade antigênica de um anticorpo é construída durante o desenvolvimento dos linfócitos B, mediante um processo de recombinação de DNA chamado rearranjo V(D)J. Quando o rearranjo que produz as regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo é finalizado e a maturação de afinidade concluída, aquele será o único tipo de anticorpo que produzirá aquele clone de linfócito B, agora diferenciado em plasmócito. Apesar de diferentes anticorpos almejarem o mesmo antígeno, fenômeno chamado policlonalidade, o repertório de recombinações possíveis para um determinado antígeno é limitado, ainda que enorme e variável em diferentes indivíduos. Recentemente, um novo sistema de edição gênica controlada foi descrito, que utiliza a enzima nuclease Cas9 com habilidade de clivar a dupla fita de DNA em uma região específica determinada por um RNA guia (gRNA). Este sistema é chamado CRISPR/Cas9 (do inglês, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Após a clivagem pela Cas9, enzimas de reparação tentam religar a dupla-fita de DNA, porém erros aleatórios, como deleções e adições de nucleotídeos, são frequentemente cometidos. Quando as deleções/adições não são múltiplas de três, a tradução daquele gene é danificada gerando um nocaute. Nosso objetivo é utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear rearranjos V(D)J que produzem anticorpos anti-nAChR em plasmócitos autorreativos de pacientes com Miastenia Grave. Para tanto, a partir de células mononucleares do sangue periférico de dez pacientes com MG, vamos isolar clones individuais de plasmócitos autoreativos, e extrair e sequenciar o éxon da região variável da imunoglobulina, que contém o rearranjo V(D)J. Vamos construir, para cada paciente MG, um plasmídeo contendo o gene da Cas9 e até sete gRNA que tenham como alvo rearranjos V(D)J autorreativos. Ao transfectar o plasmídeo nos plasmócitos dos pacientes MG, esperamos observar uma redução considerável na produção de anticorpos anti-nAChR in vitro. Trata-se de um projeto inédito com o objetivo de utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear recombinações V(D)J e depletar autoanticorpos patogênicos em uma doença autoimune. Este modelo poderá indicar o caminho para uma nova estratégia terapêutica para enfermidades autoimunes baseadas em autoanticorpos patogênicos. (AU)