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Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmócitos autorreativos

Processo: 17/20745-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de novembro de 2018 - 31 de outubro de 2022
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Pesquisador responsável:Gerson Dierley Keppeke
Beneficiário:Gerson Dierley Keppeke
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo, SP, Brasil
Pesq. associados:Luiz Eduardo Coelho Andrade
Assunto(s):Edição de RNA  Reumatologia  Autoanticorpos  Recombinação V(D)J  CRISPR-Cas9  Plasmócitos 

Resumo

Autoanticorpos são marcadores de doenças autoimunes e em alguns casos estão diretamente envolvidos em sua fisiopatologia, tendo papel patogênico direto, como no caso da Miastenia Grave (MG), causada por anticorpos contra o receptor nicotínico de acetilcolina (anti-nAChR). A especificidade antigênica de um anticorpo é construída durante o desenvolvimento dos linfócitos B, mediante um processo de recombinação de DNA chamado rearranjo V(D)J. Quando o rearranjo que produz as regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo é finalizado e a maturação de afinidade concluída, aquele será o único tipo de anticorpo que produzirá aquele clone de linfócito B, agora diferenciado em plasmócito. Apesar de diferentes anticorpos almejarem o mesmo antígeno, fenômeno chamado policlonalidade, o repertório de recombinações possíveis para um determinado antígeno é limitado, ainda que enorme e variável em diferentes indivíduos. Recentemente, um novo sistema de edição gênica controlada foi descrito, que utiliza a enzima nuclease Cas9 com habilidade de clivar a dupla fita de DNA em uma região específica determinada por um RNA guia (gRNA). Este sistema é chamado CRISPR/Cas9 (do inglês, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Após a clivagem pela Cas9, enzimas de reparação tentam religar a dupla-fita de DNA, porém erros aleatórios, como deleções e adições de nucleotídeos, são frequentemente cometidos. Quando as deleções/adições não são múltiplas de três, a tradução daquele gene é danificada gerando um nocaute. Nosso objetivo é utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear rearranjos V(D)J que produzem anticorpos anti-nAChR em plasmócitos autorreativos de pacientes com Miastenia Grave. Para tanto, a partir de células mononucleares do sangue periférico de dez pacientes com MG, vamos isolar clones individuais de plasmócitos autoreativos, e extrair e sequenciar o éxon da região variável da imunoglobulina, que contém o rearranjo V(D)J. Vamos construir, para cada paciente MG, um plasmídeo contendo o gene da Cas9 e até sete gRNA que tenham como alvo rearranjos V(D)J autorreativos. Ao transfectar o plasmídeo nos plasmócitos dos pacientes MG, esperamos observar uma redução considerável na produção de anticorpos anti-nAChR in vitro. Trata-se de um projeto inédito com o objetivo de utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear recombinações V(D)J e depletar autoanticorpos patogênicos em uma doença autoimune. Este modelo poderá indicar o caminho para uma nova estratégia terapêutica para enfermidades autoimunes baseadas em autoanticorpos patogênicos. (AU)