Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmócitos autorreativos

• Processo: 17/20745-1
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2018
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2023
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina
• Pesquisador responsável: Gerson Dierley Keppeke
• Beneficiário: Gerson Dierley Keppeke
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Pesquisadores associados: Luiz Eduardo Coelho Andrade
• Bolsa(s) vinculada(s): 22/00862-1 - Avaliação de técnicas para inserção de ácidos nucleicos em plasmócitos, BP.IC; 21/04588-9 - Construção de um ensaio baseado em células para detecção de anticorpos contra o receptor de acetilcolina, BP.MS; 18/25444-2 - Depleção de autoanticorpos por edição gênica com o sistema CRISPR/Cas9 em plasmócitos autorreativos, BP.JP
• Assunto(s): Edição de RNA Reumatologia Autoanticorpos Recombinação V(D)J CRISPR-Cas9 Plasmócitos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Autoanticorpos | Cas9 | Crispr | edição gênica | Miastemia Grave | Plasmócitos autorreativos | Recombinação V(D)J | Reumatologia

Resumo

Autoanticorpos são marcadores de doenças autoimunes e em alguns casos estão diretamente envolvidos em sua fisiopatologia, tendo papel patogênico direto, como no caso da Miastenia Grave (MG), causada por anticorpos contra o receptor nicotínico de acetilcolina (anti-nAChR). A especificidade antigênica de um anticorpo é construída durante o desenvolvimento dos linfócitos B, mediante um processo de recombinação de DNA chamado rearranjo V(D)J. Quando o rearranjo que produz as regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo é finalizado e a maturação de afinidade concluída, aquele será o único tipo de anticorpo que produzirá aquele clone de linfócito B, agora diferenciado em plasmócito. Apesar de diferentes anticorpos almejarem o mesmo antígeno, fenômeno chamado policlonalidade, o repertório de recombinações possíveis para um determinado antígeno é limitado, ainda que enorme e variável em diferentes indivíduos. Recentemente, um novo sistema de edição gênica controlada foi descrito, que utiliza a enzima nuclease Cas9 com habilidade de clivar a dupla fita de DNA em uma região específica determinada por um RNA guia (gRNA). Este sistema é chamado CRISPR/Cas9 (do inglês, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Após a clivagem pela Cas9, enzimas de reparação tentam religar a dupla-fita de DNA, porém erros aleatórios, como deleções e adições de nucleotídeos, são frequentemente cometidos. Quando as deleções/adições não são múltiplas de três, a tradução daquele gene é danificada gerando um nocaute. Nosso objetivo é utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear rearranjos V(D)J que produzem anticorpos anti-nAChR em plasmócitos autorreativos de pacientes com Miastenia Grave. Para tanto, a partir de células mononucleares do sangue periférico de dez pacientes com MG, vamos isolar clones individuais de plasmócitos autoreativos, e extrair e sequenciar o éxon da região variável da imunoglobulina, que contém o rearranjo V(D)J. Vamos construir, para cada paciente MG, um plasmídeo contendo o gene da Cas9 e até sete gRNA que tenham como alvo rearranjos V(D)J autorreativos. Ao transfectar o plasmídeo nos plasmócitos dos pacientes MG, esperamos observar uma redução considerável na produção de anticorpos anti-nAChR in vitro. Trata-se de um projeto inédito com o objetivo de utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear recombinações V(D)J e depletar autoanticorpos patogênicos em uma doença autoimune. Este modelo poderá indicar o caminho para uma nova estratégia terapêutica para enfermidades autoimunes baseadas em autoanticorpos patogênicos. (AU)

Publicações científicas

(8)

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

KEPPEKE, GERSON D.; BARCELOS, DENISE; FERNANDES, MARIANA; COMODO, ANDREIA N.; GUIMARAES, DAIANE P.; CARDILI, LEONARDO; CARAPETO, FERNANDO C. L.; ANDRADE, LUIS E. C.; LANDMAN, GILLES. IMP dehydrogenase rod/ring structures in acral melanomas. PIGMENT CELL & MELANOMA RESEARCH, JAN 2020. (17/20745-1, 17/10547-8)

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KEPPEKE, GERSON DIERLEY; SATOH, MINORU; KAYSER, CRISTIANE; MATOS, PEDRO; HASEGAWA, TOMOKO; TANAKA, SHIN; DIOGENES, LARISSA; AMARAL, ROGERIO QUINTILIANO; RODRIGUES, SILVIA HELENA; ANDRADE, LUIS EDUARDO COELHO. A cell-based assay for detection of anti-fibrillarin autoantibodies with performance equivalent to immunoprecipitation. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 13, p. 11-pg., 2022-09-26. (17/20745-1, 21/04588-9)

KEPPEKE, GERSON DIERLEY; DIOGENES, LARISSA; GOMES, KETHELLEN; ANDRADE, LUIS EDUARDO COELHO. "Untargeting" autoantibodies using genome editing, a proof-of-concept study. Clinical Immunology, v. 251, p. 12-pg., 2023-04-26. (21/04588-9, 17/20745-1)

CHANG, CHIA-CHUN; KEPPEKE, GERSON DIERLEY; ANTOS, CHRISTOPHER L.; PENG, MIN; COELHO ANDRADE, LUIS EDUARDO; SUNG, LI-YING; LIU, JI-LONG. TPS forms the cytoophidium in zebrafis. Experimental Cell Research, v. 405, n. 2, AUG 15 2021. (17/20745-1)

KEPPEKE, GERSON D.; BARCELOS, DENISE; FERNANDES, MARIANA; COMODO, ANDREIA N.; GUIMARAES, DAIANE P.; CARDILI, LEONARDO; CARAPETO, FERNANDO C. L.; ANDRADE, LUIS E. C.; LANDMAN, GILLES. IMP dehydrogenase rod/ring structures in acral melanomas. PIGMENT CELL & MELANOMA RESEARCH, v. 33, n. 3, p. 490-497, MAY 2020. (17/20745-1, 17/10547-8)

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