| Processo: | 18/25952-8 |
| Modalidade de apoio: | Auxílio à Pesquisa - Regular |
| Vigência: | 01 de abril de 2019 - 31 de março de 2021 |
| Área do conhecimento: | Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia |
| Pesquisador responsável: | Sandro Roberto Marana |
| Beneficiário: | Sandro Roberto Marana |
| Instituição Sede: | Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil |
| Assunto(s): | Cinética enzimática |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | Beta-glucosidases | Cinética Enzimática | Dinamica de Proteinas | estrutura quaternária | Imidazol glicerol sintase | redes de estrutura proteíca | enzimologia |
Resumo
Este projeto divide-se em duas linhas de investigação: 1 - Estrutura Quaternária e Cinética Enzimática em beta-GlicosidasesA determinação de estruturas cristalográficas e experimentos de filtração em gel já demonstraram claramente que a formação de oligômeros é largamente distribuída dentre as b-glicosidases GH1. Por outro lado, embora haja relatos de efeitos da oligomerização sobre a sua atividade enzimática, estes são divergentes indo desde a inativação até o aumento de atividade. Nota-se que neste aspecto não há um estudo detalhado do efeito da oligomerização sobre os parâmetros cinéticos das b-glicosidases GH1, sendo muitas vezes feita apenas uma medida de atividade enzimática. A estrutura cristalográfica e experimentos de SAXS da ²-glucosidase Sfbgly (5CG0) demonstraram a existência de um dímero desta enzima. Para estudar a relação entre os parâmetros de cinética enzimática e a dimerização de Sfbgly propomos buscar o isolamento das formas monoméricas e diméricas de Sfbgly através de cromatografia de filtração em gel com detecção por "Multi-Angle Light Scattering" (SEC-MALS). Uma vez isoladas, as amostras de monômeros e dímeros serão submetidas à caracterização em experimentos de cinética enzimática de estado estacionário com determinação de Km e kcat. Adicionalmente, propomos introduzir mutações sítio-dirigidas na interface de dimerização de Sfbgly, buscando gerar mutantes que sejam exclusivamente monoméricas. Estas Sfbgly mutantes também serão submetidas à caracterização por SEC-MALS e cinética enzimática.Por fim, também buscaremos avaliar o estado de oligomerização nas b-glicosidases das bactérias Thermatoga maritima (Tmbglu; CAA52276) e Paenibacillus polymyxa (BglB; AAA22264), empregando SEC-MALS. Paralelamente, amostras de Tmbglu e BglB purificadas serão caracterizadas em experimentos de cinética enzimática (determinação de Km e kcat).Em conclusão, será viável traçar uma relação entre os estados oligoméricos e parâmetros cinéticos (Km e kcat), reportando detalhadamente pela primeira vez a relação entre a estrutura quaternária e atividade catalítica em b-glicosidases GH1.2 - Redes Estruturais e Termoestabilidade em Proteínas.Já foi reportado que a estrutura terciária de uma proteína pode ser analisada como uma rede, um conjunto de pontos (nós; resíduos de aminoácidos) que mantêm contato entre si (conexão; interação não-covalente). Interessantemente, apesar dos milhares de contatos de uma rede de estrutura proteica, apenas cerca de 4 deles já são suficientes para ligar quaisquer dois resíduos de aminoácido. Neste contexto, resíduos com alta centralidade, também chamados hubs, são aqueles essenciais para determinação deste caminho curto entre quaisquer dois pontos da rede proteica. Enfim, os resíduos hubs garantem uma rápida navegação pela estrutura da proteína.Experimentos conduzidos no projeto anterior mostraram que substituições dos resíduos hubs e seus vizinhos diretos alteram a estabilidade térmica das enzimas HisF e Sfbgly. É razoável assumir que a energia térmica no aquecimento se distribua pela estrutura da proteína, modificando a dinâmica de seus resíduos. Deste modo, pode-se propor a hipótese de que mutações dos resíduos hub modifiquem a distribuição da energia térmica através de conjuntos de resíduos da estrutura proteica. Além disso, a hipótese sugere que dada a alteração na distribuição de energia térmica, a dinâmica dos resíduos da proteína seria distinta nas HisF selvagem e mutantes com substituição dos resíduos hubs. Neste contexto analisaremos a correlação das variações do parâmetro de ordem S2 (obtido em NMR) em diferentes temperaturas com a centralidade dos resíduos na rede da estrutura de HisF selvagem. Finalmente, estes aspectos serão comparados entre a HisF selvagem e uma mutante com alteração em um resíduo hub.Em conclusão, os experimentos desta linha poderão descrever o papel da rede estrutural e seus resíduos hubs na distribuição da energia térmica na estrutura proteica. (AU)
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