Busca avançada
Ano de início
Entree

Triagem de ligantes enzimáticos: uma abordagem on-flow via LC-MS/MS

Processo: 19/05363-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de outubro de 2019 - 30 de setembro de 2021
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química
Pesquisador responsável:Carmen Lúcia Cardoso
Beneficiário:Carmen Lúcia Cardoso
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Pesq. associados:Adriana Ferreira Lopes Vilela
Assunto(s):Imobilização de enzimas  Produtos naturais 

Resumo

A identificação de substâncias com atividade biológica em extratos naturais ou oriundas de coleções sintéticas é uma etapa crucial e complexa e promove um crescente interesse no uso de técnicas rápidas e eficientes de separação e de triagem. Tal paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem que facilitem e reduzam o tempo empregado na identificação dessas substâncias.Amplamente difundido, o uso de ensaios enzimáticos off-line em solução envolve várias limitações, entre elas a pouca compatibilidade das enzimas com solventes orgânicos. A baixa estabilidade aliada ao alto custo de purificação torna os ensaios on-line utilizando enzimas em solução uma etapa pouco viável para triagem de alta eficiência. Em contrapartida, a realização dos ensaios biológicos on-line, empregando enzimas imobilizadas é uma alternativa valiosa. As enzimas imobilizadas possuem maior estabilidade na presença de solventes orgânicos e variações de temperatura, além de permitir a reutilização e o uso de pequenas quantidades de enzima. Empregando-se técnicas cromatográficas, o isolamento de princípios ativos oriundos de um extrato natural raramente pode ser concretizado em uma única etapa cromatográfica. As separações 2D por cromatografia líquida já são bem estabelecidas e podem ser classificadas em abrangente, pseudo-abrangente e "heart-cutting". No modo abrangente (LCxLC) todo o efluente da primeira dimensão, ou parte representativa dele, é introduzida na segunda dimensão. Em heart-cutting (LC-LC) somente frações selecionadas são transferidas para a segunda coluna. Métodos 2D são, portanto, uma estratégia valiosa para se obter maior eficiência na separação com redução do tempo de análise. Métodos clássicos de fracionamento de extratos naturais bioguiados envolvem alto consumo de tempo, enquanto que triagens off-line não resultam em informações sobre os compostos individuais e muitas vezes apresentam resultados falsos positivos ou falsos negativos. Como alternativa o acoplamento das técnicas de separação cromatográfica 2D com os ensaios biológicos, chamados de triagem de alta eficiência é promissora. Dessa forma, é possível detectar a atividade biológica diretamente no eluente do LC e caracterizar quimicamente o(s) composto(s) biologicamente ativos online, resultando em redução do tempo e trabalho despendidos na coleta das frações para posterior detecção de atividade. O uso da cromatografia seletiva de afinidade, utilizando IMERs tem sido explorado com eficiência através de cromatografia frontal, zonal (linear e não linear). Além disso, a cromatografia zonal pode ser empregada com sistemas 2D hifenados a diferentes detectores.Com a proposta de desenvolvimento de novos modelos de triagem na identificação de substâncias ativas em coleções naturais e/ou sintéticas utilizando métodos online e enzimas imobilizadas, alvos importantes e protocolos de imobilização foram selecionados, destacando-se as enzimas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) a serem imobilizadas individualmente, as kalikreinas (KLK1- KLK-6 e KLK-8) imobilizadas individualmente mas utilizadas em sistemas online paralelos (metodologia home made), além das enzimas Acetilcolinesterase (AChE) e beta-secretase-1 (BACE1) que serão co-imobilizadas para aplicação em estudos de inibidores dual target. (AU)