Desenvolvimento de kits para detecção de COVID-19 pelo método de RT-PCR multiplex em tempo real e colorimétrico por RT-LAMP

• Processo: 20/04954-2
• Linha de fomento: Auxílio à Pesquisa - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
• Vigência: 01 de julho de 2020 - 30 de junho de 2022
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Saúde Coletiva - Saúde Pública
• Convênio/Acordo: FINEP - PIPE/PAPPE Subvenção
• Pesquisador responsável: Naiara Utimura Torres
• Beneficiário: Naiara Utimura Torres
• Empresa: Cellco Biotec do Brasil Ltda
• Município: São Carlos
• Pesq. associados: Fernanda Cristina Costa
• Auxílios(s) vinculado(s): 20/06637-4 - Desenvolvimento de kits para detecção de COVID-19 pelo método de RT-PCR multiplex em tempo real e colorimétrico por RT-LAMP, AP.PIPE
• Bolsa(s) vinculada(s): 20/12041-7 - Produção de enzimas essenciais na aplicação das técnicas de RT-qPCR e RT-LAMP, BP.TT
• Assunto(s): Pandemias COVID-19 SARS-CoV-2 Infecções por Coronavirus Técnicas e procedimentos diagnósticos Testes imediatos Técnicas de diagnóstico molecular Técnicas de amplificação de ácido nucleico Reação em cadeia da polimerase multiplex Técnica de amplificação isotérmica mediada por loop com transcriptase reversa (RT-LAMP) Técnicas in vitro

Resumo

O surto da doença causada pelo novo coronavírus (COVID-19) foi declarado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma Emergência de Saúde Pública de Importância Internacional e posteriormente como uma pandemia. Mundialmente já foram notificados mais de 50 mil mortes e apesar de esforços mundiais, ainda não há vacina ou tratamentos específicos eficazes. A estratégia recomendada pela OMS para conter o avanço dessa pandemia consiste em isolamento social e a rápida identificação dos casos de infecção. Para tanto, testes de diagnósticos são de extrema importância e uma demanda de no mínimo 15 milhões de testes foi estimada pelo Ministério da Saúde para suprir as necessidades do Brasil. O teste de amplificação de ácido nucleico (NAATs) do vírus através de RT- PCR em tempo real é o diagnóstico recomendado pela OMS por apresentar alta sensibilidade e especificidade, sendo capaz de detectar a infecção no início. No entanto os reagentes necessários para esse teste, atualmente, devem importados e apresentam-se escassos internacionalmente devido a magnitude da pandemia. Portanto esse projeto tem como objetivo inicial e imediato a viabilização de um teste para RT-PCR em tempo real multiplex totalmente produzido no Brasil. A Cellco produz, atualmente, 90% dos insumos necessários para compor o teste padrão sendo capaz de rapidamente validar e estabelecer o kit completo e fornecer para centros aptos a realizar o teste. No entanto, sabe-se que os teste por RT-qPCR são elaborados e requerem equipamentos específicos e pessoal altamente treinado, o que representa outro gargalo na capacidade de realização de testes em massa. Para contornar esse outro obstáculo, propomos estabelecer um teste rápido e de simples execução através da técnica de RT-LAMP. A aplicação dessa metodologia para diagnósticos tem sido altamente explorada por ser possível sua adaptação para testes colorimétricos com a sensibilidade e especificidade de outros testes por amplificação de ácido nucleico. Adicionalmente o teste pode ser aplicado diretamente a amostras clínicas, sem a necessidade de extração de ácido nucleico. A Cellco já produz a enzima base da metodologia LAMP, a DNA Polimerase I de Basillus stearothermophilus (Bst), em sua forma nativa e mutantes que apresentam maior processividade e resistência a inibidores comuns nas reações de PCR. Propomos, portanto, o desenvolvimento de um kit de RT-LAMP, sua adaptação para teste colorimétrico e viabilização para testes rápidos de coronavírus. Essa metodologia se baseia em oligonucleotídeos específicos, tornando possível a manutenção de sua sensibilidade e especificidade mesmo com mutações e diferentes cepas do vírus. Com esse projeto pretendemos, portanto, suprir rapidamente a demanda nacional do teste padrão de RT-qPCR e em paralelo desenvolver um teste rápido pela metodologia de RT-LAMP que permita um que um grande número de testes seja realizado para minimizar os efeitos do surto de COVID-19. (AU)