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Desenvolvimento de kits para detecção de COVID-19 pelo método de RT-PCR multiplex em tempo real e colorimétrico por RT-LAMP

Resumo

O surto da doença causada pelo novo coronavírus (COVID-19) foi declarado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma Emergência de Saúde Pública de Importância Internacional e posteriormente como uma pandemia. Mundialmente já foram notificados mais de 50 mil mortes e apesar de esforços mundiais, ainda não há vacina ou tratamentos específicos eficazes. A estratégia recomendada pela OMS para conter o avanço dessa pandemia consiste em isolamento social e a rápida identificação dos casos de infecção. Para tanto, testes de diagnósticos são de extrema importância e uma demanda de no mínimo 15 milhões de testes foi estimada pelo Ministério da Saúde para suprir as necessidades do Brasil. O teste de amplificação de ácido nucleico (NAATs) do vírus através de RT- PCR em tempo real é o diagnóstico recomendado pela OMS por apresentar alta sensibilidade e especificidade, sendo capaz de detectar a infecção no início. No entanto os reagentes necessários para esse teste, atualmente, devem importados e apresentam-se escassos internacionalmente devido a magnitude da pandemia. Portanto esse projeto tem como objetivo inicial e imediato a viabilização de um teste para RT-PCR em tempo real multiplex totalmente produzido no Brasil. A Cellco produz, atualmente, 90% dos insumos necessários para compor o teste padrão sendo capaz de rapidamente validar e estabelecer o kit completo e fornecer para centros aptos a realizar o teste. No entanto, sabe-se que os teste por RT-qPCR são elaborados e requerem equipamentos específicos e pessoal altamente treinado, o que representa outro gargalo na capacidade de realização de testes em massa. Para contornar esse outro obstáculo, propomos estabelecer um teste rápido e de simples execução através da técnica de RT-LAMP. A aplicação dessa metodologia para diagnósticos tem sido altamente explorada por ser possível sua adaptação para testes colorimétricos com a sensibilidade e especificidade de outros testes por amplificação de ácido nucleico. Adicionalmente o teste pode ser aplicado diretamente a amostras clínicas, sem a necessidade de extração de ácido nucleico. A Cellco já produz a enzima base da metodologia LAMP, a DNA Polimerase I de Basillus stearothermophilus (Bst), em sua forma nativa e mutantes que apresentam maior processividade e resistência a inibidores comuns nas reações de PCR. Propomos, portanto, o desenvolvimento de um kit de RT-LAMP, sua adaptação para teste colorimétrico e viabilização para testes rápidos de coronavírus. Essa metodologia se baseia em oligonucleotídeos específicos, tornando possível a manutenção de sua sensibilidade e especificidade mesmo com mutações e diferentes cepas do vírus. Com esse projeto pretendemos, portanto, suprir rapidamente a demanda nacional do teste padrão de RT-qPCR e em paralelo desenvolver um teste rápido pela metodologia de RT-LAMP que permita um que um grande número de testes seja realizado para minimizar os efeitos do surto de COVID-19. (AU)

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