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Disseminando a "revolução da resolução" na América Latina, por meio de estudos em Cryo-EM de uma hemocianina de molusco, com impacto biomédico substancial

Resumo

O notável progresso na biologia estrutural possibilitado pela microscopia crio-eletrônica de partículas simples (cryo-EM), originou a chamada "revolução da resolução", principalmente devido à sua capacidade de fornecer informações estruturais de alta resolução de complexos proteicos grandes e dinâmicos. Recentemente, o Brasil adquiriu um microscópio Titan Krios de última geração que, quando em operação no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), estabelecerá este país como líder no campo de crio-EM na América Latina. No entanto, para otimizar o uso e a ocupação de tais instalações pela comunidade de biologia estrutural, torna-se urgente capacitar pesquisadores nos laboratórios da região. O amplo acesso a essa metodologia, por meio de esforços colaborativos entre grupos de pesquisa do Chile e do Brasil, representa uma oportunidade inestimável para promover ainda mais o desenvolvimento científico regional, empregando uma metodologia de ponta. Aqui, propomos uma abordagem sinérgica para determinar a estrutura cryo-EM da hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), um organismo marinho endêmico das costas do Pacífico sul. As hemocianinas são oligômeros do tamanho de megadaltons que participam do transporte de oxigênio em múltiplos organismos invertebrados. Hemocianinas são usadas como imunoestimulantes naturais não tóxicos e inespecíficos com aplicações biomédicas e clínicas fundamentais; Assim, entender os mecanismos moleculares precisos das hemocianinas é essencial para a melhoria futuras dessas aplicações. Atualmente, a hemocianina mais bem estudada do ponto de vista estrutural e imunológico é a KLH, de Megathura crenulate. Por meio de uma combinação de cryo-EM e cristalografia por difração de raios X, os detalhes atômicos das unidades funcionais que compõem o KLH foram revelados, exibindo anéis homodecaméricos altamente simétricos apresentando regiões glicosiladas extensivamente. Entretanto, estudos de hemocianinas homólogas de outros organismos marinhos comprovaram que há um grau significativo de diversidade estrutural entre eles, especialmente em relação aos padrões de glicosilação, o que pode explicar sua eficiência desigual em gerar efeitos adjuvantes apropriados para terapias imunológicas orientadas. Estudos realizados por pesquisadores chilenos, também associados a essa proposta, mostraram recentemente que a CCH é uma das hemocianinas mais promissoras para aplicações biomédicas. A CCH possui estabilidade e solubilidade superiores às dos homólogos, sendo a mais efetiva na indução de respostas imunológicas, como observado em estudos pré-clínicos de vacinas contra o câncer e imunocastração. No entanto, apesar do potencial biomédico único da CCH, sua estrutura e até mesmo sua sequência de aminoácidos permanecem desconhecidas. A caracterização bioquímica preliminar de CCH foi demonstrada que duas cadeias polipeptídicas distintas formam anéis heterodiméricos, em oposição aos anéis homodiméricos de KLH. Cada subunidade de CCH parece ter oito domínios globulares de ligação ao oxigênio, denominados unidades funcionais (FU), que são diferencialmente glicosiladas. Neste contexto, propomos três objetivos principais: (i) determinar a sequência do gene CCH através do sequenciamento de RACE, (ii) determinar a estrutura de pelo menos uma de suas unidades funcionais por meio de cristalografia de raios X e (iii) determinar a arquitetura geral do CCH através do cryo-EM de partículas individuais. Procuramos combinar o acesso aos espécimes de Concholepas concholepas e os conhecimentos especializados sobre a biologia molecular e bioquímica deste organismo pelos pesquisadores chilenos, e o conhecimento em determinação de estruturas usando cristalografia de raios-X e crio-EM da contraparte brasileira. Uma vantagem adicional no lado brasileiro é o acesso geográfico substancialmente mais fácil a sofisticados instrumentos multiusuários dedicados à biologia estrutural, como o Titan Krios (no LNNano / CNPEM) e a fonte síncrotron SIRIUS... (AU)