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Seleção de inibidores das proteases NS2B/NS3 dos vírus Dengue e Zika através de bibliotecas de peptídeos cíclicos e ensaios de triagem de alto desempenho (high-throughput screening)

Resumo

Tanto para o vírus Zika quanto para o Dengue, a protease NS2B/NS3, que é formada durante o processo de replicação desses vírus na célula hospedeira, é essencial para o processamento da denominada poli-proteína viral. Sendo que a inibição da atividade desta enzima bloqueia a replicação do vírus na célula hospedeira. Portanto, inibidores dessas proteases são potenciais fármacos antivirais. O principal objetivo desse projeto é o desenvolvimento de inibidores para a protease NS2B/NS3 do vírus Dengue assim como do vírus Zika. Nossa proposta é utilizar ensaios celulares para seleção de potenciais inibidores dessas enzimas gerados em uma biblioteca de peptídeos cíclicos. A rigidez da cadeia cíclica confere uma maior resistência a clivagem por proteases quando comparado com a mesma sequência peptídica linear, com isso, peptídeos cíclicos estão sendo apontados como protótipos de inibidores ou até mesmo como possíveis inibidores de proteases. Pretendemos utilizar uma técnica baseada nas propriedades de inteínas divididas, abreviada por SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular Ligation Of Peptides and ProteinS), associada à randomização de códons. Essa técnica permite a geração de bibliotecas celulares de milhares de peptídeos cíclicos. Ex: uma biblioteca com 6 códons randomizados pode gerar até 64.000.000 de diferentes peptídeos cíclicos. Para seleção de um possível inibidor, deve-se acoplar a biblioteca com um ensaio celular para a seleção de clones positivos (inibidores da NS2B/NS3). Para isso, além do peptídeo cíclico, deverão também ser produzidos no interior da célula hospedeira: a protease NS2B/NS3 e um substrato dessa enzima, cujo produto seja tóxico para a célula. Quando o peptídeo cíclico (em um dos clones da biblioteca) inibir a protease impedindo a formação do produto tóxico, a célula deverá sobreviver (clones positivos). Caso o peptídeo não iniba a protease, a célula não sobreviverá (clones negativos). Após a seleção dos clones positivos, os peptídeos cíclicos correspondentes, identificados por sequenciamento de DNA, serão produzidos para testes cinéticos in vitro, para a confirmação da triagem. A presente solicitação de auxílio regular se baseia em dois projetos de doutorado já em andamento, cujas enzimas alvo são exatamente as proteases NS2B/NS3 do Dengue e do Zika. Porém, caso consigamos comprovar a eficácia da tecnologia proposta estenderemos a seleção de inibidores para outras proteases virais, incluindo a protease 3C do COVID-19, cuja inibição também pode bloquear a replicação viral. (AU)