Liberação de uma proteína semelhante à DNase pelo Paracoccidioides brasiliensis que degrada NETs e permite o escape fúngico

• Processo: 21/03141-0
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2021
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Celular
• Pesquisador responsável: Luciane Alarcão Dias-Melicio
• Beneficiário: Luciane Alarcão Dias-Melicio
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina (FMB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
• Município da Instituição Sede: Botucatu
• Vinculado ao auxílio: 18/09706-7 - Identificação e purificação de DNAse produzida por fungos do complexo de espécies Paracoccidioides spp e sua ação sobre NETS (Neutrophil Extracellular Traps) liberadas por neutrófilos humanos em resposta ao fungo, AP.R
• Assunto(s): Neutrófilos Paracoccidioides brasiliensis Paracoccidioidomicose Armadilhas extracelulares
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: DNAse | Escape Mechanism | NETs | neutrophils | Paracoccidioides brasiliensis | Paracoccidioidomycosis | Imunologia da Paracoccidioidomicose

Resumo

A paracoccidioidomicose é uma doença fúngica sistêmica, considerada endêmica na América Latina. Seus agentes etiológicos, fungos do complexo Paracoccidioides, possuem habitat geográfico restrito, conídios como forma infectante e características termo-dimórficas. Os neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) são responsáveis por uma importante resposta de defesa contra fungos, liberando redes extracelulares de neutrófilos (NETs), que podem envolver e destruir as leveduras. No entanto, foi descrito que alguns patógenos são capazes de escapar dessas estruturas de DNA, liberando DNase como um mecanismo de escape. Como diferentes padrões de NETs foram identificados em culturas de PMNs desafiadas com diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis, o objetivo geral deste estudo foi identificar se diferentes padrões de NETs liberados por PMNs humanos desafiados com isolados de Pb18 (virulento) e Pb265 (avirulento) estariam correlacionado com a capacidade do fungo de produzir uma proteína semelhante à DNase. Assim, PMNs de indivíduos saudáveis foram isolados e desafiados in vitro com ambos os isolados fúngicos. A produção, liberação e conformação de NETs em resposta aos fungos foram avaliadas por microscopia confocal, microscopia de varredura e quantificação de NETs. A identificação da produção de DNase fúngica foi avaliada pelo Agar DNase TEST, e a expressão gênica relativa para proteínas hipotéticas foi investigada por RT-qPCR, cujos genes foram identificados no genoma fúngico presente no GenBank (PADG_11161 e PADG_08285). Foi possível verificar a liberação de NETs pelos PMNs, evidenciando a formação de diferentes NETs quando em contato com diferentes isolados do fungo. O isolado Pb18 induziu a liberação de NETs mais soltas, maiores e mais parecidas com NETs degradadas em comparação com o isolado Pb265, que induziu a liberação de NETs mais densas e compactas. O Ágar DNase TEST identificou a produção de uma proteína semelhante à DNase, mostrando que apenas o Pb18 apresentou capacidade de degradar o DNA nessas placas. Além disso, pudemos identificar que os genes PADG_08528 e PADG_11161 foram mais expressos durante a interação com neutrófilos pelo isolado virulento, sendo PADG_08528 altamente expresso nessas culturas, demonstrando que este gene poderia ter uma contribuição maior na produção da proteína. Assim, identificamos que o isolado virulento está induzindo mais NETs dispersas e soltas, provavelmente pela liberação de uma proteína semelhante à DNase. Esse fator pode ser um importante mecanismo de escape utilizado pelo fungo para escapar da ação dos NETs. (AU)