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Avaliação da citoproteção mediada por canabinóides, via modulação da autofagia, em células-tronco pluripotente induzidas (iPS) e mioblastos C2C12: estabelecimento de um modelo in vitro para estudos de caquexia neoplásica

Resumo

As células tronco-pluripotentes induzidas humanas (iPS) são uma fonte ilimitada de células com potencial pluripotente semelhante à das células tronco embriônicas, mas geradas a partir de células somáticas. Estudos in vitro de modelagem de doenças com estas células têm se destacado na triagem de fármacos, pois estas representam muito melhor as doenças humanas do que o modelo animal. Assim, utilizando progenitores miogênicos e miotubos obtidos a partir de células iPS, estudaremos o papel da autofagia e sua modulação por canabinóides na proteção destas células após insultos citotóxicos, objetivando a identificação de mecanismos envolvidos na perda da massa muscular, a qual é desencadeada por várias doenças crônicas, inclusive pelo câncer em estágio avançado (caquexia do câncer ou caquexia neoplásica). Buscaremos mais precisamente identificar alvos moleculares/celulares específicos que possam controlar a progressão de eventos de proteólise e/ou morte celular. Para isto, utilizaremos como modelo de estudos os progenitores miogênicos iPS (linhagem PLZ), gentilmente cedidos para a realização deste projeto pela Prof. Dr. Perlingeiro (University of Minneosta, MN, USA). Estes progenitores foram obtidos após a reprogramação de fibroblastos humanos durante o desenvolvimento das minhas atividades na Universidade de Minnesota, MN, USA (BPE-FAPESP 18/07633-2). Estas células iPS, assim como mioblastos murinos C2C12 serão submetidas ao tratamento com os moduladores farmacológicos da autofagia (rapamicina e cloroquina), e então desafiadas com quimioterápicos que induzem caquexia em indivíduos sob tratamento com fármacos antitumorais, como a cisplatina. A cardiotoxina (CTX), meio condicionado de células tumorais (RXT393) e palmitato também serão avaliados na indução de citotoxicidade nestas células, por representarem modelos de indução de perda da massa muscular em diferentes condições fisiopatológicas. A partir destes ensaios, avaliaremos os possíveis efeitos citoprotetores dos fito-canabinóides como o canabidiol (CDB), a Canabidivarina (CBDV) e o tetrahydrocannabivarin (THCV) e possível participação da autofagia nestes eventos. Para responder a todos estes objetivos, ensaios de cultura, proliferação e morte celular por citometria de fluxo e pela técnica de TUNEL serão utilizados. Testes de imunofluorescência serão aplicados na avaliação morfológica e quantificação de miotubos obtidos nos diferentes tratamentos. As proteínas envolvidas na via de autofagia e nos processos musculares contráteis serão estudadas pela técnica de Western blotting. O ensaio de qRT-PCR também será aplicado para entendermos a modulação de genes envolvidos nos processos autofágico e contrátil. Como resultado, esperamos a obtenção de dados sólidos sobre os mecanismos moleculares envolvidos na modulação da autofagia por canabinóides com possível controle na perda da massa muscular. O estabelecimento da cultura de células iPS humanas na triagem de fármacos capazes de controlar os eventos da caquexia neoplásica também é foco deste projeto. Salientamos que poucos trabalhos são verificados na literatura sobre os estudos aqui propostos, o que faz deste projeto inovador em todos os aspectos. Várias orientações poderão ser realizadas dentro deste projeto pela sua proposta abrangente, envolvendo diferentes modelos de indução de proteólise/morte celular e sua possível proteção farmacológica por fito-canabinóides e outros compostos. A possibilidade de intercâmbio entre alunos da Universidade de Minnesota e a UNIFESP, também é um diferencial desta proposta. (AU)

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