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Caracterização funcional das E3 ubiquitina-ligases do tipo CRL (Cullin RING-ligases) em Leishmania infantum

Processo: 20/15771-6
Modalidade de apoio:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de novembro de 2021 - 31 de outubro de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Felipe Roberti Teixeira
Beneficiário:Felipe Roberti Teixeira
Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Pesquisadores associados:Adriano Cappellazzo Coelho ; Eva Gluenz ; Jeziel Dener Damasceno ; Marcelo Damário Gomes ; Sandra Regina Costa Maruyama
Assunto(s):Parasitologia molecular  Leishmaniose  Leishmania infantum  CRISPR-Cas9  Via da ubiquitina-proteassoma  Ubiquitina-proteína ligases  Proteínas ligases SKP culina F-box 
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:CRISPR-Cas9 | E3 ubiquitina ligase | leishmania infantum | sistema ubiquitina proteassoma | Parasitologia molecular

Resumo

O sistema ubiquitina proteassoma (SUP) é o principal responsável pela proteólise intracelular em eucariotos e o processo de ubiquitinação se dá pela ação de três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3 (ubiquitina-ligases) que exercem papel-chave neste processo, reconhecendo e transferindo ubiquitina para o substrato proteico. Estes podem ser direcionados ao proteassoma para degradação ou terem suas funções reguladas por esta modificação. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente para o sucesso do parasitismo. Pouco se sabe sobre o SUP em muitos parasitos, incluindo os tripanossomatídeos do gênero Leishmania, responsáveis por causarem as leishmanioses. No Brasil, a espécie Leishmania infantum é o agente etiológico da leishmaniose visceral (LV), a forma mais grave da doença, podendo ser fatal se não tratada. O proteassoma de Leishmania possui subunidades com alto grau de identidade ao de humanos, e vem sendo alvo de drogas para tratamento de leishmanioses. Recentemente, foram caracterizadas as enzimas E2 e deubiquitinases de L. mexicana, demonstrando o papel essencial na proliferação e infectividade dessa espécie. Por outro lado, as E3 ubiquitina-ligases de Leishmania permanecem não estudadas. Neste projeto, propomos caracterizar bioquimicamente os genes de L. infantum LINF_110018100), LINF_210005300 e LINF_240029100 que são ortólogos aos genes humanos SKP1, RBX1 e CUL1 respectivamente. Estes são componentes da mais bem estudada classe de E3 ligases em humanos, denominada Cullin RING Ligases (CRLs) ou SCF (SKP, Cullin, F-box). Para isso, parasitos da espécie L. infantum serão geneticamente modificados por meio da estratégia CRISPR-Cas9 para geração de linhagens nocautes ou expressando estes genes em fusão com as tags 3xmyc-mCherry. Realizaremos a caracterização fenotípica das linhagens (crescimento, infectividade e susceptibilidade a drogas in vitro) e bioquímica, por meio de imunoprecipitação das proteínas em fusão com myc tag, seguido de análise por espectrometria de massas para identificação dos ligantes. Buscaremos no interactoma das proteínas SKP, Cullin e RBX de L. infantum os potenciais componentes das CRLs deste parasito. Por fim, ensaios de validação de interação proteína-proteína e ubiquitinação in vitro e in vivo serão realizados. Os resultados deste projeto contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito e a sua relação com o hospedeiro, podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento das leishmanioses. (AU)

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Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
TAKAMIYA, NAYORE TAMIE; ROGERIO, LUANA APARECIDA; TORRES, CAROLINE; LEONEL, JOAO AUGUSTO FRANCO; VIOTI, GEOVANNA; OLIVEIRA, TRICIA MARIA FERREIRA DE SOUSA; VALERIANO, KAROLINE CAMILA; PORCINO, GABRIANE NASCIMENTO; SANTOS, ISABEL KINNEY FERREIRA DE MIRANDA; COSTA, CARLOS H. N.; et al. Parasite Detection in Visceral Leishmaniasis Samples by Dye-Based qPCR Using New Gene Targets of Leishmania infantum and Crithidia. TROPICAL MEDICINE AND INFECTIOUS DISEASE, v. 8, n. 8, p. 25-pg., . (21/12464-8, 16/18527-3, 18/26799-9, 19/19789-0, 16/20258-0, 21/10358-6, 20/15771-6, 20/14011-8, 17/16328-6)
DOS PASSOS, PATRICIA M. S.; SPAGNOL, VALENTINE; DE CORREIA, CAMILA R. S. T. B.; TEIXEIRA, FELIPE R.. Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates. JOVE-JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS, v. N/A, n. 183, p. 11-pg., . (20/15771-6, 16/20258-0)

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