Avaliação histopatológica de testículo, epidídimo e glândula submandibular de camundongos K18-hace2 infectados por SARS-CoV-2

• Processo: 21/07207-6
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Vigência: 01 de junho de 2022 - 31 de outubro de 2024
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Histologia
• Pesquisador responsável: Estela Sasso Cerri
• Beneficiário: Estela Sasso Cerri
• Instituição Sede: Faculdade de Odontologia (FOAr). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
• Pesquisadores associados: Barry Thomas Hinton ; Paulo Sergio Cerri
• Assunto(s): Infecções por Coronavirus SARS-CoV-2 COVID-19 Citocinas Glândulas salivares Epididimo Testículo Espermatogênese
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: citocinas | espermatogênese | Glândula Salivar | SARS-CoV-2 | Testículo | Biologia Estrutural e Funcional

Resumo

As proteínas ACE2 e TMPRSS2 permitem a entrada do vírus SARS-CoV-2 na célula hospedeira, provocando a Covid-19, uma síndrome respiratória aguda grave. Além das células pulmonares, essas proteínas estão presentes em níveis consideráveis nas células das glândulas salivares, dos testículos e do epidídimo. Sabe-se que a saliva é um importante meio de transmissão do SARS-CoV-2, e as glândulas salivares são sítios para infecção, replicação e transmissão viral. Além da saliva, alguns estudos têm demonstrado a presença do vírus no sêmen, bem como baixos níveis de testosterona e alterações testiculares e epididimárias em pacientes com Covid-19. Tanto o testículo quanto o epidídimo são órgãos com características únicas e complexas que garantem a espermatogênese, bem como a maturação e armazenamento dos espermatozoides, garantindo a fertilidade masculina. Aumento de citocinas causado por infecções virais podem afetar estes órgãos e comprometer a espermatogênese, a esteroidogênese e a integridade dos espermatozoides. A criação recente do novo camundongo transgênico K18-hACE2 tem contribuído para o estudo da covid-19, pois esses animais expressam a ACE2 humana (hACE2). Desta forma, a proteína spike do vírus liga-se à hACE2 nas células desses animais, infectando-as e causando a doença. Neste estudo, será proposto verificar quais células expressam hACE2 e se são infectadas pelo vírus nos tecidos das glândulas submandibulares, testículos e epidídimos de camundongos K18-hACE2 infectados pelo SARS-CoV-2. Será também avaliada a presença de infiltrado inflamatório e de citocinas pró-inflamatórias, bem como o impacto da infecção na integridade estrutural e funcional destes órgãos. Serão utilizados 12 camundongos K18-hACE2 adultos, distribuídos em 2 grupos (n=6): grupo controle (GC) e grupo 5 dias (G5D). Os animais do G5D serão inoculados com o vírus por via intranasal. Os animais do GC serão inoculados com meio de cultura DMEM. Após 5 dias, os órgãos serão coletados, fixados e processados para inclusão em parafina para as análises morfológicas e morfométricas. Fragmentos testiculares e epididimários serão incluídos em Araldite para análise ultraestrutural ao microscópio eletrônico de transmissão (MET). Amostras também serão congeladas (-80°C) para análise molecular (qPCR). Nos cortes histológicos dos órgãos avaliados, serão realizadas reações de imunofluorescência para detecção de ACE2, TMPRSS2 e proteína viral spike, bem como de citocinas pró-inflamatórias (IL-1±, IL-1², IL-2, IL-6, IFN-³, TNF-±) e incidência de morte celular pelo método do TUNEL. Nos testículos, os níveis de TMPRSS2, ACE2, IFN-³, MIF, iNOS e NF-kB serão avaliados por Western Blot, enquanto que os níveis de testosterona, IL-1², IL-6 e TNF-± serão avaliados por ELISA. As áreas tubular e epitelial serão mensuradas, e o número de células de Sertoli, de espermatócitos, bem como de túbulos alterados será quantificado. Reações de imunofluorescência ou imuno-histoquímica serão realizadas para detecção de: Ki-67 (mitose/meiose), conexina-43 (proteína da barreira hemato-testicular), StAR (proteína esteroidogênica), NF-kB, iNOS, linfócitos T (CD8, CD4) e macrófagos (CD68, CD163). Nos cortes epididimários, além das citocinas, o número de macrófagos CD11c e F4/80-positivos, bem como a imunoexpressão da VATPase (bomba de prótons) nas células claras será avaliada por immunofluorescência. Nos cortes de glândulas submandibulares, além das citocinas, será avaliada a densidade de volume de ductos, ácinos e estroma glandular, bem como a imunoexpressão de EGF e V-ATPase. Os resultados das análises quantitativas das reações serão submetidos à análise estatística pelo Student-t test (pd0,05). Nos testículos e epidídimos, a avaliação das alterações ultraestruturais, bem como a possível confirmação da presença do vírus nos tecidos/células será realizada por meio da MET e RT-PCR em tempo real. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

BELTRAME, FLAVIA LUCIANA; MOYSES, THIAGO HENRIQUE PEREIRA; COELHO, MONICA PEREIRA; STEINVASCHER, MARIA CLARA ROSSETTO; DE OLIVEIRA, SALMO AZAMBUJA; DA SILVA, ANDRE ACACIO SOUZA; CERRI, PAULO SERGIO; SASSO-CERRI, ESTELA. Role of serotonin, estrogen, and TNF-a in the paroxetine-impaired steroidogenesis and testicular macrophages polarization. ANDROLOGY, v. N/A, p. 19-pg., 2023-09-07. (22/10560-2, 21/07207-6, 17/19829-6, 21/09328-5)