Identificação de fatores celulares críticos durante a infecção por arbovírus neurotrópicos através do screening global com bibliotecas CRISPR-Cas9

• Processo: 22/11885-2
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Pesquisador Visitante - Brasil
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2023
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2024
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
• Pesquisador responsável: Thiago Mattar Cunha
• Beneficiário: Thiago Mattar Cunha
• Pesquisador visitante: Rafael Freitas de Oliveira Franca
• Instituição do Pesquisador Visitante: Ministério da Saúde (Brasil). Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brasil
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08216-2 - CPDI - Centro de Pesquisa em Doenças Inflamatórias, AP.CEPID
• Assunto(s): Inflamação Vírus Chikungunya Vírus Zika
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: dano tecidual | Inflamação | Neurotropismo | Vírus Chikungunya | Vírus Mauaro | Vírus Zika | Farmacologia da inflamação

Resumo

As arboviroses representam um grave problema de saúde pública o qual tem seagravado nos últimos anos devido à inserção de novos vírus em populações altamentesusceptíveis. A circulação concomitante de diferentes vírus resulta em uma carga elevada aossistemas de saúde, o qual encontra-se despreparado para lidar com as diferentes formas clínicasdestas infecções. Sabe-se que a infecção por arbovírus geralmente resulta em um quadro febrilagudo, no entanto uma parcela significativa das infecções cursa para o desenvolvimento dequadros neurológicos graves. Neste contexto, os mecanismos moleculares que participam nocontrole da infecção versus evolução das diferentes formas clínicas permanecem desconhecidos.A presente proposta visa avaliar a aplicabilidade de uma biblioteca CRISPR-Cas9 como ferramentapara a identificação de fatores críticos para a infecção e dano celular ocasionado por diferentesarbovírus de interesse. Essa biblioteca consiste no agrupamento de 77.441 guias direcionadaspara a deleção de aproximadamente 19 mil genes humanos. Desta maneira, poderemos realizarum rastreio (screening) global do genoma humano para fatores relacionados à resposta dohospedeiro frente à infecção experimental por arbovírus, por meio da deleção gênica mediada porCRISPR/Cas9 em células permissivas. Após a construção de clones celulares expressando aenzima Cas9 constitutivamente e transdução da biblioteca por lentivirus, submeteremos aspopulações de células knockout à infecção letal com isolados dos vírus Zika, Chikungunya eMayaro. Por fim, iremos determinar genes e vias envolvidos na replicação e dano celular atravésdo sequenciamento das células sobreviventes e identificação das guias presentes naquelapopulação. Os genes identificados serão ranqueados e agrupados de acordo com a via ouprocesso celular o qual participam através de ferramentas de anotação gênica (Gene Ontology).Ensaios funcionais para os genes identificados serão posteriormente realizados, podendo incluir,mas não limitados a: i) ensaios de avaliação da carga viral para genes codificantes de receptorese/ou proteínas de superfície ii) ensaios de avaliação da morte celular para genes envolvidos nasinalização para apoptose ou outras formas de morte celular iii) perfil de citocinas e quimiocinasinflamatórias para genes envolvidos na ativação da inflamação. Desta maneira, a presenteproposta poderá contribuir na identificação de vias moleculares envolvidas na infecção porarbovírus, podendo acrescentar novos conhecimentos acerca dos processos da interaçãovírus-hospedeiro, os quais por sua vez podem levar à descoberta de potenciais novos alvosterapêuticos. (AU)