Resumo
O sistema ubiquitina proteassoma (SUP) é o principal responsável pela proteólise intracelular em eucariotos sendo constituído pelas enzimas E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e E3 (ubiquitina-ligases) que promovem a ubiquitinação dos substratos proteicos e o proteassoma, uma macroestrutura proteolítica responsável pela degradação dos alvos ubiquitinados. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente para o sucesso do parasitismo. Nenhum estudo até o momento caracterizou os componentes do SUP em Leishmania infantum, o agente etiológico da leishmaniose visceral (LV) no Brasil, a forma mais grave entre as leishmanioses e que pode ser fatal se não tratada. Através de análises de bioinformática, buscando domínios conservados em proteínas do SUP de Homo sapiens em L. infantum, identificamos 91 genes relacionados ao SUP neste parasito, sendo 3 enzimas E1, 15 E2s e 47 genes de E3 ligases subdivididas em: 15 componentes de CRLs, 5 Single RING ligases, 13 tipo HECT, 4 U-box, 9 componentes das APCs -Anaphase Promoting Complex, 1 RING between RING, 3 COP9 signalossoma e 25 componentes do proteassoma. Diante da importância do SUP na homeostase celular e a falta de estudos deste sistema em L. infantum, esta proposta tem por objetivo entender o papel do SUP em promastigotas e amastigotas, bem como na infectividade em células de mamíferos por meio de CRISPR-Cas9 e Bar-seq. Produziremos mutantes nulos dos genes do SUP identificados e marcados individualmente com uma sequência nucleotídica única (barcode) e as linhagens viáveis serão reunidas em uma cultura de promastigotas (pooled culture) cultivadas em diferentes tempos (0h, 24h, 48h e 168h), diferenciadas em amastigotas axênicas (24h e 72h) e usadas para infecção in vitro (12h e 72h) em macrófagos. Identificaremos e quantificaremos por meio de sequenciamento e análise bioinformática, os genes requeridos para o desenvolvimento dos parasitos em cada condição experimental. Após validação dos efeitos do nocaute gênico na proliferação, diferenciação e infectividade dos parasitos, os genes de interesse serão caracterizados funcionalmente através da identificação de parceiros proteicos no parasito por espectrometria de massas e localização intracelular por microscopia confocal. Os resultados deste projeto contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito e a sua relação com o hospedeiro, podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento da leishmaniose visceral. (AU)
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