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Determinacao de um possivel metodo para a quantificacao de enzimas proteoliticas secretadas por bacterias de interesse biotecnologico atraves da utilizacao de substratos de fluorescencia apagada.

Processo: 98/00817-5
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de junho de 1998 - 30 de novembro de 1999
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
Pesquisador responsável:Ivo Lebrun
Beneficiário:Ivo Lebrun
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Tétano  Toxinas  Substratos 

Resumo

A toxina tetânica é uma neurotoxina produzida pela cepa toxigênica Clostrídium tetani, secretada como uma simples cadeia polipeptídica de 150 Kda, que é clivada por várias proteases, gerando duas cadeias polipeptídicas, uma leve e uma pesada, ligadas por ponte dissulfeto. A cadeia pesada é responsável pela fixação da toxina na junção neuromuscular, enquanto a cadeia leve é responsável pelo efeito tóxico. A cadeia leve é considerada uma metaloprotease, com um zinco ligado a ela, sendo capaz de hidrolisar substratos protéicos específicos, como as sinaptobrevinas. Atualmente a quantificação da toxina é feita através do ensaio de Limite de Floculação (Lf), que determina a quantidade de toxina produzida pela imunoprecipitação com um antisoro padrão utilizando duas séries de diluições sucessivas. Este método, embora internacionalmente aceito, possui vários inconvenientes, podendo haver precipitação inespecífica. O ensaio é demorado e a sensibilidade é baixa. Sendo assim, com base nas informações sobre o mecanismo de ação enzimático da toxina tetânica, procuraremos estudar um possível método de quantificação mais sensível e específico através da utilização de substratos peptídicos com apagamento intramolecular, desenhados a partir da seqüência da sinaptobrevina, que contém a ligação peptídica susceptível à enzima. Devido à importância da toxina tetânica na produção de vacinas, e como estudo mais intensivo das neurotoxinas clostridiais, é importante que se desenvolva um método de quantificação de toxina mais sensível, específico e rápido. Estes resultados poderiam ser aplicados no melhoramento de técnicas já utilizadas, e também ser estendidos para quantificar outras toxinas clostridiais. (AU)

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