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Contribuição do estudo de proteínas da cadeia respiratória para a caracterização molecular das doenças mitocondriais

Processo: 07/04312-6
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de novembro de 2007 - 31 de maio de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Célia Harumi Tengan
Beneficiário:Célia Harumi Tengan
Instituição-sede: Departamento de Neurologia e Neurocirurgia. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):08/00785-0 - Screening de mutações nas doenças mitocondriais, BP.TT
Assunto(s):Encefalomiopatias mitocondriais  Diagnóstico clínico  Mutação  Eletroforese em gel 

Resumo

Existe uma grande dificuldade no diagnóstico das encefalopatias mitocondriais pois a maior parte delas não apresenta alterações à biópsia muscular. As principais causas de encefalopatias mitocondriais incluem deficiências do Complexo I e uma investigação molecular é bastante difícil devido a um enorme número de genes envolvidos nesta doença. O principal método para o diagnóstico destas formas de doença mitocondrial se baseia na análise das atividade dos complexos respiratórios por espectrofotometria. Entretanto, este método não está disponível facilmente no Brasil, e nem no exterior, onde é realizado somente em centros especializados. Além disso, uma série de problemas técnicos, dificultam a utilização deste método em larga escala. Assim, objetivo deste projeto é avaliar a contribuição do estudo de proteínas da cadeia respiratória para a identificação e caracterização dos defeitos moleculares envolvidos nas doenças mitocondriais. Pretendemos comparar diferentes métodos de análise de proteínas da fosforilação oxidativa em pacientes com doença mitocondrial com defeitos moleculares diversos e verificar se o padrão de expressão de proteínas pode auxiliar no diagnóstico e direcionar a investigação para a identificação da mutação genética responsável pela doença. Compararemos os seguintes métodos: Western blotting multiplex (com a utilização de 5 painéis de anticorpos); análise após imunocaptura dos complexos respiratórios (imunoprecipitação de proteínas de cada complexo isoladamente, seguida de eletroforese em gel e visualização com a coloração com nitrato de prata); BN-PAGE (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) onde é feita a eletroforese dos complexos respiratórios mantidos íntegros, com detecção por imunoblotting , além da detecção da atividade in gel de cada complexo respiratório. Todos estes métodos serão comparados ao método tradicional de análise da atividade dos complexos por espectrofotometria. As amostras utilizadas para esta comparação serão obtidas de linhagens cíbridas contendo DNAmt normal e mutações no DNAmt, fibroblastos obtidos de controles e pacientes com doença mitocondrial confirmada ou alta suspeita diagnóstica. Após a comparação dos métodos, verificaremos qual método poderia nos auxiliar no diagnóstico e a sua aplicabilidade em amostras pequenas, como aquelas obtidas de biópsia muscular. (AU)

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