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Identificação e quantificação da expressão de fatores determinantes de pluripotência em embriões bovinos e em células tronco derivadas de embriões PIV

Processo: 10/00065-7
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de abril de 2010 - 31 de março de 2012
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Fernanda da Cruz Landim
Beneficiário:Fernanda da Cruz Landim
Instituição-sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Assunto(s):Expressão gênica  Técnicas in vitro  Pluripotência  Bovinos  Embrião 

Resumo

É essencial para o aprimoramento das terapias e tratamentos celulares que o processo de manutenção e caracterização do cultivo celular das células tronco, seja dominado e que se conheça o processo de diferenciação celular. Os modelos experimentais de células-tronco em camundongos têm propiciado informações relevantes para transplantes de células-tronco em outras espécies animais. No entanto, apesar de compartilharem similaridades quanto a morfologia e alguns marcadores de superficie celular e de expressão gênica, as CTE possuem características únicas em cada espécie. A expressão dos marcadores de pluripotência pode ser determinada por análise do RNA por meio da transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ou pela detecção protéica por imunohistoquímica Em bovinos, a imunohistoquímica é muito utilizada, havendo escasso uso de expressão gênica por RT-PCR, sendo inexistente, na literatura, uma comparação entre a expressão de RNA mensageiro codificador da proteína e a presença dessa proteína, relacionados à pluripotência. Portanto a investigação dos fatores de transcrição envolvidos com a regulação da pluripotência em embriões pré-implantação de animais domésticos deve fornecer informações importantes com relação ao desenvolvimento embrionário inicial e derivação de células tronco embrionárias nessas espécies. Desta forma o objetivo geral deste experimento é desenvolver uma metodologia adequada para isolamento, manutenção e caracterização de células tronco embrionárias obtidas de embriões bovinos (CTEbov) produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos bovinos serão produzidos in vito e submetidos a marcação imunocitoquimica para detecção da distribuição dos fatores marcadores de CTE OCT4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 e a atividade da fosfatase alcalina. Alem disso, serão cultivadas células da MCI dos embriões, por pelo menos 5 passagens, as quais também serão submetidas a marcação pelos mesmos fatores. O estudo da expressão gênica será realizado tanto nas células em cultivo, como nos embriões intactos, analisando-se os genes OCT4, Sox2, Akp2, Stat3, GBX2 e ZFP42. (AU)