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Caracterização do perfil de N-glicanas e proteínas modificadas por O-GlcNAc pela incorporação de azido-açúcares análogos em carboidratos nas linhagens celulares melan-a, TM1 e TM5

Processo: 09/02065-7
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de junho de 2009 - 30 de novembro de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:José César Rosa
Beneficiário:José César Rosa
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Proteínas  Polissacarídeos  N-acetil-manosamina azida  Uridina difosfato N-acetilglicosamina  Glicoproteínas  Espectrometria de massas 

Resumo

A presente proposta investigará o perfil de N-glicanas e de proteínas modificadas por O-GlcNAc nas linhagens celulares murinas melan-a, TM1 e TM5 utilizando uma abordagem glicoproteômica. As linhagens celulares objetos de estudo da presente proposta representam um modelo murino de progressão de tumoral: Melan-a, linhagem não tumorigênica foi obtida a partir de melanócitos, enquanto TM1 e TM5 são duas linhagens tumorigênicas derivadas de melan-a que apresentam um fenótipo de crescimento vertical (VGP). TM1 e TM5 foram obtidas por um processo de de-adesão pelo impedimento de ancoragem em meio de cultura das células que sobreviveram a anoikis. Serão realizadas as seguintes investigações: 1) Estudos de incorporação metabólico aos carboidratos dessas linhagens celulares de azido-açúcares análogos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) e N-acetilmanosamina (ManNAc), comercialmente disponíveis, na forma de N-azidoacetilglicosamina acetilado (Ac4GlcNAz) e N-azidoacetilmanosamina acetilada (Ac4ManNAz) 2) Caracterização de glicoproteínas N-glicosiladas e 3) glicoproteínas modificadas por O-GlcNAc. Os açucares não naturais Ac4GlcNAz e Ac4ManNaz são incorporados nas moléculas de carboidratos como N-acetilglicosamina e ácido sialico nas células utilizando as vias de biossíntese normais. Eles contem um grupo reativo azida que reage seletivamente com um grupo Phosphine (PH3) em uma reação denominada de ligação de Staudinger, a qual permite uma enorme variedade de marcação incluindo sondas fluorescentes e rótulos para afinidade como biotina e peptídeo FLAG. A estratégia para detecção e isolamento de proteínas modificadas pós-tradução baseado na marcação por substratos modificados é denominado como tagging-via-substrate ou tecnologia TAS. TAS será utilizado para a detecção e identificação de modificações de proteínas por O-GlcNAc e N-glicanas por um combinação de um complexo de FLAG/Biotina/estreptavidina. Glicoproteinas serão analizadas por espectrometria de massas após separação de glicanas e proteínas por tratamento com endoglicanase F e separação cromatográfica em fase reversa para a identificação das proteínas e determinação estrutural de glicanas. O foco dessa investigação será a analise global das glicoproteinas providenciando um conhecimento básico em glicobiologia e produzindo candidatos a biomarcadores de melanoma. (AU)