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Expressão em Escherichia coli e produção de anti-soros para proteínas não estruturais do Southern Bean mosaic vírus visando identificação e caracterização dos produtos gênicos

Processo: 07/06666-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de maio de 2008 - 30 de abril de 2010
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Agronomia - Fitossanidade
Pesquisador responsável:José Osmar Gaspar
Beneficiário:José Osmar Gaspar
Instituição-sede: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Proteômica  Expressão gênica  Vírus de plantas 

Resumo

No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro, citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV), do gênero Sobemovirus, que já foi detectado no Distrito Federal, no Estado de São Paulo (SBMV-SP) e no Estado do Paraná. Os sobemovírus possuem partículas virais isométricas com cerca de 30 nm de diâmetro, com uma única camada proteica formada por 180 subunidades com massa molecular igual a 26-34 kDa. O RNA genômico é uma molécula de fita única e polaridade positiva com tamanho de aproximadamente 4,0 a 4,5 kb. A região 5’ terminal do RNA possui uma proteína ligada ao genoma (VPg) e na região 3’ terminal falta uma cauda poliadenilada. Os sobemovírus possuem organização genômica com quatro ORFs, produzindo a proteína P1 (possível proteína do movimento célula-a-célula), a protease-VPg, a polimerase-RdRp e a proteína capsidial. Algumas propriedades moleculares foram determinadas para o isolado SBMV-SP, incluindo-se o seqüenciamento total do genoma. Nos últimos anos houve um substancial acúmulo de conhecimento a respeito dos sobemovírus. Entretanto, a melhor compreensão da organização do genoma, dos mecanismos de transmissão, das relações vírus/vetor, dos mecanismos de replicação, movimento intercelular e movimento sistêmico, localização subcelular das proteínas não estruturais, relações com organelas celulares, sítios de replicação, etc., ainda estão para ser determinadas. Particularmente em relação ao SBMV, muito ainda há para ser estudado sobre importantes aspectos do ciclo de multiplicação desse vírus. Muitas das indicações de funções carecem de comprovação através de dados laboratoriais, produzidos in vitro e in vivo. Esses estudos envolvem (a) transcrição/tradução in vitro dos diferentes genes, (b) detecção das proteínas em tecidos infectados, utilizando-se as técnicas de fracionamento celular, imunoprecipitação, “Western Blot” e imunolocalização por microscopia eletrônica de transmissão, (c) clonagem do genoma viral (“full-length cDNA clone”) e produção de mutantes com deleções parciais ou totais de genes em vetor de expressão que permite multiplicação na planta, etc. Em todas essas técnicas a existência de anti-soros específicos para as diferentes proteínas é de importância fundamental. Para tanto, a purificação dessas proteínas a partir de tecidos de plantas infectadas seria o ponto inicial para a imunização de coelhos. Entretanto, com exceção da proteína capsidial, as outras proteínas (não estruturais), ocorrem em concentrações muito baixas nas plantas infectadas tornando o processo de purificação difícil, tedioso e quase impossível. Por outro lado as técnicas de clonagem e expressão de genes de interesse em Escherichia coli vêm sendo utilizadas com sucesso para obtenção de quantidades apropriadas de proteínas, as quais podem ser purificadas e utilizadas na produção de anti-soros específicos. (AU)