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Luciferases de coleópteros: evolução estrutural e funcional, e engenharia para fins biotecnológicos

Processo: 09/09120-3
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de janeiro de 2010 - 31 de dezembro de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Radiologia e Fotobiologia
Pesquisador responsável:Vadim Viviani
Beneficiário:Vadim Viviani
Instituição-sede: Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). Campus de Sorocaba. Sorocaba, SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):10/15143-3 - Manutenção e organização de Laboratório de Bioquímica e biotecnologia: técnicas básicas de biologia molecular, expressão heteróloga e purificação de luciferases, BP.TT
Assunto(s):Fotobiologia  Bioluminescência  Luciferases  Lampyridae  Físico-química  Mutagênese sítio-dirigida  Técnicas biossensoriais 

Resumo

As luciferases de vagalumes são as enzimas que produzem a bioluminescência em organismos como vagalumes. Estão sendo amplamente utilizadas para finalidades bioanalíticas nas áreas médica (Diagnósticos, e estudos pré-clínicos de patologias como infecções bacterianas, virais e câncer), biotecnológica (biossensores luminescentes) e ambiental (biossensores de toxicidade). Todas estas aplicações utilizam umas poucas luciferases oriundas dos vagalumes Norte-americano, europeu e japoneses que produzem luz verde-amarela e são sensitivas ao pH. Nosso grupo de pesquisa clonou ao longo dos ultimos anos várias luciferases de besouros brasileiros, dentre as quais luciferases únicas que produzem luz vermelha de Phrixotrix hirtus e verde-azulada de Pyrearinus termitilluminans, e luciferases pH-sensitivas de Macrolampis e Cratomorphus distinctus. Através de mutagênese sítio-dirigida, modelagem, e estudos funcionais, demonstramos que o loop entre os resíduos 223-235 desempenha um papel essencial na determinação dos espectros de bioluminescência. A interação deste loop com os resíduos E311 e R337 são aparentemente responsáveis pela manutenção de uma conformação apropriada do sítio-ativos das luciferases, responsável pela emissão de luz verde-amarela. Estudos físico-químicos indicam que o sítio ativo das luciferases verde é mais hidrofóbico que aquele da luciferase vermelha. Entretanto, ainda não conseguimos determinar que resíduos estão especificamente envolvidos com as mudanças dos espectros de bioluminescência e com a sensibilidade ao pH. Através de estudos de mutagênese sítio-dirigigida, modelagem, caracterização físico-química destas luciferases, pretendemos identificar os resíduos importantes para as cores de bioluminescência nas luciferases de Phrixotrix e Pyrearinus, e sensibilidade ao pH nas luciferases de Macrolampis e Cratomorphus. Além disto, através de mutagênese sítio-dirigida e randômica, pretendemos estabilizar estas luciferases quanto a temperatura e cinética, para torná-las mais apropriadas par fins biotecnológicos, especificamente para uso como reagente bioanalíticos e como genes repórter para células de mamíferos. Também estaremos tentando determinar as estruturas tridimensionais em colaboração com o Prof. João Barbosa (LNLS, Campinas). (AU)

Matéria(s) publicada(s) na Agência FAPESP sobre o auxílio:
Que haja luz 
Patente(s) depositada(s) como resultado deste projeto de pesquisa

ENZIMA AMP-COA-LIGASE ATIVA DE (ZOPHOBAS MORIO), LUCIFERASE DESENVOLVIDA POR ENGENHARIA GENÉTICA, PROCESSO PARA IMPLEMENTAR ATIVIDADE LUCIFERÁSICA EM AMP-COA-LIGASES, PROCESSO DE INIBIÇÃO DA ATIVIDADE LUMINESCENTE DA PROTOLUCIFERASE PARA A PRÉ-SELEÇÃO E BIOPROSPECÇÃO DE SUBSTRATOS CARBOXÍLICOS, BIOSENSOR CELULAR E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA BR1020120094029 - Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR) . Vadim Vivian; Rogilene A. Prado - 20 de abril de 2012

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