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Análise dos domínios hipervariáveis de anticorpos antivenenos animais e anticorpos recombinantes antibacterianos

Processo: 09/51496-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de novembro de 2009 - 30 de abril de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Imunologia - Imunoquímica
Pesquisador responsável:Wilmar Dias da Silva
Beneficiário:Wilmar Dias da Silva
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Antivenenos  Venenos de origem animal  Imunoglobulina G  Imunoglobulina Y  Afinidade de anticorpos  Proteínas recombinantes  Expressão gênica  Clonagem 

Resumo

A) Titular anticorpos IgG (cavalo) e IgY (Gallus gallus) durante a imunização com venenos de serpentes e escorpiões. Avaliar a afinidade dos anticorpos usando veneno total e frações representativas dos venenos usados para imunizar os animais. Isolar anticorpos de alta e de baixa afinidade. Coletar sangue (cavalos) ou baço (Gallus gallus) representativos das fases de produção de anticorpos de alta e baixa afinidade. Isolar linfócitos e purificar DNA e RNA. Com auxílio de sondas específicas isolar e amplificar por PCR as regiões correspondentes aos CDRs de anticorpos de alta e baixa afinidade. Identificar sequências possivelmente tícas de anticorpos de alta e baixa afinidade. Usar essas sequências para identificar epítopos de toxinas de veneno que induzem anticorpos de alta afinidade. Tentar a construção de modelos preditivos da evolução e presença de anticorpos de alta afinidade. B) Estabelecer culturas de E. coli EPEC positivas e negativas para o fator de virulência, receptor para intimina (TIR). Expandir clones representativos de EPEC com e sem plasmídeo TIR. Estabelecer culturas de BCG estável, bem caracterizado. Expandir os vetores multifuncionais (shuttle vectors) E. coli /micobactéria pLA71, pLA73 e pMIP12, plasmídeos pontes, gentilmente cedidos pela Dra. Brigitte Gicquel do Instituto Pasteur (Paris, França). Expandir o promotor pBlaF* que expressa diferentes fragmentos do gene da b-lactamase fundidos a fosfatase alcalina (phoA). pLA71 apresenta um inserto de 1384 pb contendo o promotor pBlaF* mais a região codificadora de 32 aminoácidos da seqüência sinal de exportação da b-lactamase e 5 aminoácidos da proteína. Clonagem o gene Tir no vetor pGEM-T easy no vetor pGEM-T easy (Promega). Amplificar o gene inserido por PCR. Confirmar a clonagem em extratos representativos de DNA. Excisar o gene inserido TIR e cloná-lo nos vetores de expressão de expressão pLA71, pLA73 e pMIP12. Determinar a presença do gene inserido por sequenciamento dev DNA ev sua funcionalidade pela eventual expressão da correspondente proteína recombinante. (AU)