Análise mutacional e modos de ligação da AngII com receptor AT1: eventuais interações entre receptores da AngII e de cininas em animais deficientes em receptores B1 ou B2

• Processo: 07/03370-2
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2009
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
• Pesquisador responsável: Suma Imura Shimuta
• Beneficiário: Suma Imura Shimuta
• Instituição Sede: Departamento de Biofísica. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Angiotensina II Receptor tipo 1 de angiotensina Mutagênese sítio-dirigida Receptor B2 da bradicinina RNA mensageiro Receptor B1 da bradicinina
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: interações cruzadas entre receptores da AII e de cininas | mutação do receptor AT1 da AII | receptores de AII e modo de ação | receptores de cininas | transcrição e expressão funcional de receptores | Farmacologia

Resumo

A partir da clonagem do receptor AT1 da angiotensina II (AngII), vários estudos tem sido efetuados com a finalidade de caracterizar as respostas funcionais do receptor. Através de mutações sítio-dirigido tem sido possível identificar algumas regiões importantes na interação receptor-agonista como sítios para binding de ligantes, ativação de agonistas e acoplamento da proteína G. Em estudo anterior foi detectada maior expressão de um mutante do receptor AT1 da AngII, C18S, no interior da célula, na região perinuclear e pouca na superfície da membrana plasmática das células CHO transfectadas com esse mutante. Duas hipóteses para essa localização intracelular serão testadas: (a), se o mutante apresentaria incorreto dobramento do receptor, afetando a sua maturação, sendo assim retido no retículo endoplasmático/complexo de Golgi; ou (b), a presença dentro da célula seria devido ao processo de internalização constitutiva do receptor pela mutação promovida, como já referida para outras mutações. A primeira hipótese será testada através de estudo imunocitoquímico com calnexina, uma chaperona molecular envolvida na correta estruturação de proteínas glicosiladas durante a passagem pelo reticulo endoplasmático. A colocalização do mutante conjugado a GFP com a calnexina será feita medindo-se a fluorescência do anticorpo conjugado secundário anticoelho marcado com o fluoróforo Texas Red. A hipótese da internalização constitutiva, será testada com o uso de antagonistas específicos, que como agonistas inversos promoveriam a exteriorização dos receptores. A verificação da recuperação do processo de internalização será feita pela identificação do receptor marcado com o GFP, testes de ligação e níveis de IP3 e de Ca+2i em células previamente incubadas com os antagonistas do receptor AT1. Um segunda abordagem deste projeto será o estudo de interações cruzadas de receptores da AngII com os receptores B1 e B2 de cininas em músculos lisos de camundongos. Cininas são peptídeos que agem como hormônios locais, aumentam a permeabilidade vascular e induzem contração ou relaxamento de músculos lisos. A maioria desses efeitos é mediada pelo receptor B2, que pertence à família de receptores acoplados a proteína G. O subtipo de receptor B1 de cininas, geralmente está ausente ou pouco expresso, em tecidos normais, mas sua expressão pode ser induzida ou aumentada por injúrias patológicas. Camundongos têm sido frequentemente utilizados para a produção de animais geneticamente alterados e é comum investigar se a deleção de um gene de um receptor pode interferir na expressão e função do sistema de receptores relacionados. Estudos sistemáticos efetuados em tecidos não vascular e vascular isolados de camundongos demonstraram que o estômago e a aorta co-expressam os dois sub-tipos de cininas (B1 e B2) e da AngII (AT1 e AT2). Conforme a literatura, tanto os receptores da AngII bem como de cininas interagem para formar homo ou heterodimeros. Além disso, os receptores AT1 da AngII e B2 de cininas podem formar heterodímeros. Desde que dispomos de animais nocaute B1 e B2 investigaremos qual a consequência da deleção de um dos receptores do sistema calicreína-cinina sobre o nível de expressão de mRNA dos receptores da AngII, do receptor de cininas remanescente e a expressão e a atividade da enzima conversora da angiotensina I (ECA-1) no estomago e na aorta isolados desses animais transgênicos. Como resultados preliminares indicaram que a eficácia da resposta contrátil induzida pela AngII era reduzida no músculo vascular mas não no gástrico de animais deficientes em receptores B1 e B2, quando comparados com animais normais, daremos ênfase a nossos estudos com a utilização de tiras musculares e cultura primária de células musculares isoladas da aorta abdominal. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

RODRIGUES, ELIETE S.; MARTIN, RENAN P.; FELIPE, SANDRA A.; BADER, MICHAEL; OLIVEIRA, SUZANA M.; SHIMUTA, SUMA I.. Cross talk between kinin and angiotensin II receptors in mouse abdominal aorta. Biological Chemistry, v. 390, n. 9, p. 907-913, SEP 2009. (07/03370-2)