Resumo
Na sepse por CLP, o LPS das bactérias Gram-negativas, contribui de forma importante para SARA, por ativação dos TLRs. O pulmão é um dos órgãos afetados na sepse e os MAs podem contribuir para SARA decorrente da sepse, liberando uma segunda onda de mediadores inflamatórios amplificando esta resposta. Nós encontramos recentemente que o LPS estimula em MAs de rato as vias de sinalização intracelular, induz a expressão de enzimas e que o pré-tratamento dos MAs com insulina inibiu todos estes efeitos do LPS. Resultados recentes em nosso laboratório mostram que a capacidade fagocítica de MAs de ratos diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação com MAs de animais sadios. Portanto, nossa hipótese de trabalho é a que insulina possa modular a inflamação e a imunidade inata no pulmão durante a sepse. Será utilizado um modelo de carência relativa de insulina. Assim, na primeira parte deste projeto pretendemos estudar a intervenção da insulina na inflamação pulmonar decorrente da sepse, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão e vias de sinalização envolvidas. Animais não-diabéticos com sepse grave receberão dose única (a ser definida) de insulina NPH, por via subcutânea, 8 horas antes do sacrifício ou diariamente durante 10 dias. Os níveis glicêmicos serão determinados antes e 8 horas após do tratamento com insulina. Em paralelo, será estudado o papel da insulina na imunidade inata no pulmão analisando a atividade fagocítica e microbicida dos MAs. Para tanto serão avaliados: a) o número de células no lavado broncoalveolar, o leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) os níveis sérico de corticosterona e insulina (ELISA); c) as concentrações de citocinas (ELISA); d) a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular (imunohistoquímica; e) o índice fagocítico e a atividade microbicida contra K. pneumoniae dos MAs (microscopia óptica); e f) a expressão das enzimas COX-2 e iNOS, das moléculas envolvidas na sinalização intracelular e a expressão do receptor TLR-4 no pulmão (Western blot). Sendo o diabetes uma das dez doenças que mais vitimam a população mundial, ampliar o conhecimento sobre a resposta inflamatória e imune conseqüente da sepse em indivíduos diabéticos é de fundamental relevância. A insulina regula o metabolismo celular modulando a atividade de proteínas envolvidas na sinalização intracelular. Entretanto, pouco se conhece sobre quais cascatas de sinalização a insulina age. Assim, a segunda parte deste projeto tem por objetivo avaliar a ativação que a insulina promove no seu próprio gene, "B Cell glucokinase gene" (BGK) e seus receptores (isoformas A e B). Inicialmente será feito o isolamento das células pancreáticas e dos MAs de ratos e em seguida, a transfecção com o gene para BGK e para os receptores de insulina (IR)-A e IR-B, para posterior cultura destas células. As células B serão estimuladas com 16.7 mM de glicose por 15 minutos ou com 50 mM de KCl e/ou com várias concentrações de insulina 5 minutos antes do estimulo com glicose. Os MAs serão estimulados com LPS (100 ng/mL) e/ou com várias concentrações de insulina 5 minutos antes do estimulo com LPS. Para a análise do RNA (BGK), as células B e os AMs serão coletados 1 hora após o estimulo, pela técnica de RT-PCR. Para a análise da atividade das proteínas kinases ou fosforilação da tirosina, células b serão monitoradas por microscopia confocal por até 240 minutos após o estímulo.Um melhor conhecimento de como a insulina atua na resposta inflamatória, nos receptores da imunidade inata, na ativação de seu próprio gene, em seus receptores e de como as diferentes vias de sinalização interferem umas com as outras permitiria contribuir não apenas para a discussão sobre o uso da insulina em pacientes com sepse grave, mas também para aumentar a imunidade natural contra microorganismos patogênicos ou inibir os efeitos deletérios da inflamação. (AU)
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