Resumo
A Rede Interação Anopheles-Plasmodium: uma abordagem multidisciplinar (RAP) tem como meta principal transformar o Brasil em um dos países líderes na pesquisa de vetores de malária. A malária no mundo é a principal doença cujo agente etiológico é um mosquito. Sendo este um dos poucos países em que confluem a ocorrência da doença e o potencial científico para estudá-la, é fundamental que o Brasil fomente grupos de jovens pesquisadores, os quais poderão retribuir com produção científica por longo período. Neste cenário, é premente também que as principais instituições que desenvolvem pesquisa de culicídeos no país (algumas aqui representadas) sejam contempladas com auxílios desta natureza. Propõe-se aqui a consolidação de um grupo constituído de 15 pesquisadores e 25 alunos de 4 instituições científicas de 3 estados brasileiros: Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas Campus avançado ICB5-Rondônia (RO) Departamento de Imunologia-São Paulo (SP) Departamento de Parasitologla-São Paulo (SP) Instituto de Medicina Tropical-São Paulo (SP) Faculdade de Saúde Pública Departamento de Epidemiologia-São Paulo Instituto Butantan-SP Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Bioquímica Médica-Rio de Janeiro (RJ) Secretaria de Estado da Saúde Pública de Rondônia-(RO). O grupo já mantém colaboração científica e seus integrantes estão alocados em instituições que já têm tradição de estudos sobre vetores. Este grupo é predominantemente constituído por jovens pesquisadores que tiveram nos últimos 5 anos a expressiva produção científica de 93 artigos e a captação de cerca de R$ 4,1 milhões em auxílios à pesquisa. Da proposta: A abordagem multidisciplinar da RAP justifica-se por ser a interação Anopheles-Plasmodium muito complexa nos aspectos genéticos, fisiológicos, bioquímicos etiológicos e imunológicos, entre outros. Do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB-5) Rondônia: Este é um importante centro de pesquisa vinculado à USP que vem executando desde 2001 sua missão de desenvolver estudos relacionados às doenças tropicais, entre elas a malária, que acometem as populações da região Amazônica, e terá participação crucial no desenvolvimento do presente projeto. O ICB-5, estrategicamente localizado em área endêmica de malária no município de Monte Negro (Rondônia), será usado como instituição-base para (coleta de material biológico. Mais importante, o grupo pretende desenvolver um corredor de troca de informações entre os alunos envolvidos no projeto com treinamento via intercâmbio recíproco. Vale a pena ressaltar que a RAP proporcionará o inicio de uma meta maior do nosso grupo que é a descentralização do conhecimento científico no Brasil. Esta rede gostaria de contribuir para o desenvolvimento de um pólo atrativo na Amazônia Legal, para pesquisadores, alunos, profissionais da saúde e a própria comunidade, trazendo benefício a todos. A RAP hoje não tem a pretensão de atuar diretamente no Programa de Controle da Malária, mas sim gerar informações e criar massa crítica para que em futuro próximo esta seja uma realidade. A RAP é fruto do novo paradigma da entomologia moderna onde atuam não apenas os taxonomistas e epidemiologistas tradicionais, mas também especialistas em fisiologia, imunologia, genética, etiologia e bioquímica. Contexto teórico: A principal característica que confere importância aos insetos do gênero Anopheles (Diptera, Culicidae) no contexto da saúde pública é o hábito hematofágico de suas fêmeas. Uma conseqüência da hematofagia é a coevolução de parasitas e insetos hematófagos tomando os últimos vetores de uma série de doenças de diferentes origens parasitárias. Dessa forma hoje em nosso planeta 1 em cada 12 habitantes está infectado com algum dos patógenos causadores da Malária, Doença de Chagas, Leishmaniose, Filariose e Dengue. No caso específico da malária, que afeta atualmente cerca de 300 milhões de pessoas, a ausência de vacinas disponíveis, somada ao surgimento de resistência tanto aos inseticidas quanto às drogas terapêuticas, está entre as principais razões que levam ao atual quadro dramático do estado de prevalência de tal doença na população humana. O esforço de pesquisa, no entanto, concentrou-se nos últimos anos na obtenção de ferramentas apenas terapêuticas para o tratamento dos pacientes ou mesmo na caracterização molecular dos estágios de tal doença no hospedeiro vertebrado. Enquanto isso, métodos para o bloqueio da transmissão pelos anofelinos vetores tem sido pouco estudados e ainda não estão disponíveis. Para se controlar uma doença de tal magnitude, serão necessários avanços em diversas direções dentro do âmbito científico. Torna-se premente então o aprofundamento de estudos sobre a biologia do Plasmodium (agente etiológico da malária), dos seus vetores (Anopheles sp.) e da interação vetor-parasita. Uma vez que a interação Anopheles-Plasmodium é muito complexa nos aspectos genéticos, evolutivos, fisiológicos, etiológicos, imunológicos, entre outros, é fundamental que tais estudos sejam concebidos de forma multidisciplinar. A RAP realizará um estudo extenso e multidisciplinar endereçado à biologia dos vetores Anopheles darilingi e Anopheles aquasalis e de sua interação com o parasita Plasmodium falciparum. A proposta é constituída de oito subprojetos (objetivos) como sumarizada a seguir: Objetivo 1: Fisiologia digestiva no modelo Anopheles aquasalis. 1. Estudos de enzimas digestivas envolvidas nos diferentes estágios do processo digestivo e o seu papel na interação patógeno-hospedeiro. Estudo de inibidores enzimáticos produzidos por diferentes artrópodes visando o controle de vetores. Objetivo 2: Fosfatoma e a infecção por Plasmodlum. 2a. Identfficar no genoma de Anopheles os genes que identificam proteinas tirosinas fosfatases (PTPS); 2b. Identificar os genes de PTPs de Anopheles cuja expressão é alterada pela infecção com Plasmodlumi; 2c. Efetuar o silenciamento por RNAi de tais PTPS; 2d. Realizar o proteoma do tubo digestivo de Anopheles; 2e. Estabelecer uma relação funcional entre as PTPs de Anopheles e o processo de infecção a semelhança do que já está sendo induzido em Aedes e eventualmente chegarmos a PTPs exclusivas do vetor da malária humana. Objetivo 3: Kinoma de Anopheles e a infecção por Plasmodlum. 3a. Identificar no genoma de Anopheles os genes que identificam proteinas quinases (PTKs); 3b. Identificar os genes de PTKs de Anopheles cuja expressão é alterada pela infecção com Plasmodium; 3c. Efetuar o silenciamento por RNAi de tais PTKs; 3d. Realizar o proteoma do tubo digestivo de Anopheles; 3e. Estabelecer uma relação funcional entre as PTKs de Anopheles e o processo de infecção à semelhança do que já está sendo conduzido em Aedes e eventualmente chegarmos a PTKs exclusivas do vetor da malária humana. Objetivo 4: Caracterização transcriptômlca de glândulas salivares e do intestino médio de Anopheles aquasalis. Descrever o perfil de RNAs presentes na glândula salivar e no intestino médio de Anopheles aquasalis, caracterizando, assim, o repertório de genes expressos nestes tecidos. Objetivo 5: Imunoma funcional da glândula salivar de Anopheles sp. Mapear as atividades imunomoduladoras da glândula salivar e suas frações in vitro e in vivo em duas áreas interligadas: a) inflamação e imunidade inata; b) imunidade adquirida. Especificamente os tópicos abordados serão: Objetivo 6: Estudos populacionais em espécies de Anopheles baseados em caracteres morfométricos de asas e ovos. Estudo de caracterização populacional das espécies An. aquasalls e An. darilingi na Amazônia brasileira para avaliar-se variações intraespecíficas alares que correspondem àquelas variações genéticas já apontadas pela literatura (Refs cit). Será feito ainda para An. aquasalis o estudo de morfometria de ovos, para avaliar se estes caracteres são polimórficos em populações da Amazônia brasileira, assim como foi observado em An. aquasalis na Venezuela (Refs cit.). Objetivo 7: Isolamento de cepas de Plasmodium falciparum que infectem Anopheles aquasalis e Anopheles dariligi em laboratório. Isolar cepas de Plasmodium falciparum diretamente de pacientes da região endêmica, Monte Negro, RO, e adaptar tais cepas ao cultivo em laboratório e infecção de anofelinos. Objetivo 8: Estabelecimento de metodologia de transgênese em Anopheles aquasalis. Transferência de tecnologia de transgênese para Anopheles aquasalis, espécie brasileira transmissora de malária na região litorânea. Metodologia Mosquitos - Anopheles aquasalis são mantidos em colônia no Insetário de segurança do ICB2 (São Paulo) e serão utilizados em todos os experimentos. - Anopheles darlingi serão capturados em Rondônia, levados para o Insetário localizado no ICB5 (Monte Negro). As gerações Fl serão obtidas e processadas para todos os experimentos. Plasmodium falciparum, sangue de pacientes infectados serão coletados em Rondônia e os parasitas isolados em culturas para os experimentos de infecção em mosquitos. Análises bioquímicas - Homogeneizados de intestinos isolados de larvas e adultos e hemolinfa serão submetidos a diferentes estratégias bioquimicas de caracterização enzimática. Análise em sílico - os bancos de dados de seqüências de Anopheles gamblae, Aedes aegypti e Culex quinquefasdatus assim como Drosophila sp, serão utilizados na busca de genes associados com cada objetivo deste projeto, a fim de identificarmos alvos gênicos para a caracterização individuai e silenciamento. Análises de DNA recombinantes - metodologia de purificação de DNA e RNA e produção de cDNA de mosquitos inteiros assim como tecidos será utilizada nas análises gênicas por RT-PCR e Real Time PCR, assim como para a produção de RNA de interferênda dos genes alvo. Caracterização morfológica de populações - Populações amazônicas de Anopheles (darilngi e aquasalis) serão comparadas de acordo com caracteres morfométricos de asas e/ou caracteres morfológicos de exocórion de ovos. A morfometrla das asas seguirá os procedimentos-padrão de morfometria geométrica aplicada à entomologia médica. Sumariamente, esse método baseia-se no estudo das relações matemático-geométricas entre as nervuras estruturais das asas que tenham significado taxonômico ou microevolutivos. Já a caracterização de ovos de Anopheles aquasalls será feita mediante análise das imagens de exocórion obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A ornamentação e dados morfométricos do exocórion servirão de parâmetros comparativos entre as populações. O conjunto de dados fornecerá suporte a hipóteses de presença/ausênda de fluxo gênico interpopulacional. Os ensaios envolvendo as atividades da glândula salivar e suas frações sobre o sistema imune envolverão experimentos cem células isoladas em cultura (macrófagos, neutrófilos, células dendriticas, mastócitos, linfócitos) e modelos animais de inflamação in vivo, de acordo com protocolos já descritos na literatura (detalhes no projeto). Transgênicos: a metodologia para a obtenção de transgênicos será a mesma adotada para a produção de Anopheles stephensi e Anopheles gambiae, já descrita. Perspectivas: Em um nível mais específico, os objetivos aqui propostos poderão contribuir diretamente e/ou indiretamente para o controle da malária e de seus vetores, através de resultados como: Ampliação do conhecimento acerca do vetor Anopheles darlingi, o que poderá se complementar à iminente divulgação do genoma da espéde, gerar mais conhecimento acerca dos vetores de Plasmodium falciparum, Anopheles darlingi e Anopheles aquasalis na natureza. Estabelecimento de Anopheles aquasalis como modelo laboratorial para estudo de aspectos do ciclo da malária. Estabelecimento do ciclo de Plasmodium faldiparum em laboratório, o que enriquecerá o conhecimento sobre a doença. Ampliação do conhecimento da microevolução desses insetos, aspectos geralmente relacionados à epidemiologia. Caracterização fisiológica dos vetores, o que auxiliará na elaboração de métodos alternativos de controle desses insetos. Identificação de moléculas de potencial uso farmacológico. Identificação de moléculas de potencial utilização em insetos transgênicos. Formação de recursos humanos, nas categorias de IC, MS, DD e PD. Intercâmbio de nossos pesquisadores e alunos que poderão circular entre as instituições dos estados de RO, RJ e SP e familiarizar-se com as diversas abordagens desta proposta. 1 Aumento da produção científica do grupo, planejado em 30% para o próximo triênio. Criação de um pólo atrativo de pesquisadores, estudantes, profissionais da saúde e comunidade na Amazônia Legal. 1 Consolidação de um grupo diversificado, multidisciplinar, de produtivos jovens pesquisadores. Melhorias na massa crítica brasileira sobre a temática: malária, o que poderá levar o Brasil a uma posição de destaque no mundo. Viabilidade: A proposta científica é viável devido ao entrosamento preexistente do grupo e à sua competência já atestada pelas suas publicações, formação de recursos humanos e captação de fomento. O fato de os colaboradores constituirem uma rede multidisciplinar com domínio de múltiplas técnicas e conhecerem reciprocamente a metodologia dos colegas reforçará a interação profissional e auxiliará no dinamismo da execução e da publicação dos resultados. Os recursos aqui solicitados correspondem ao complemento necessário para a plena realização da proposta. A esses recursos deverá somar-se a infra¬estrutura (equipamentos, serviços) de que já dispomos em nossas instituições para o atendimento desta proposta. (AU)