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Participação das espécies reativas de oxigênio e ceramidas na morte de neutrófilos humanos induzida por ácidos graxos

Processo: 10/50848-8
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de maio de 2011 - 30 de abril de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia
Pesquisador responsável:Adriana Cristina Levada-Pires
Beneficiário:Adriana Cristina Levada-Pires
Instituição-sede: Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL). São Paulo , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):15/07815-5 - Vias de sinalização envolvidas na indução de apoptose de neutrófilos pelos ácidos oléico e linoléico, BP.IC
12/15079-9 - Participação do estresse de retículo na morte de neutrófilos induzida por ácidos graxos, BP.IC
11/10627-5 - Papel das espécies reativas de oxigênio e ceramidas na morte de neutrófilos humanos induzida por ácidos graxos, BP.JP
Assunto(s):Biologia celular  Espécies de oxigênio reativas  Ceramidas  Morte celular  Neutrófilos  Ácidos graxos  Toxicidade 

Resumo

Neste projeto, estudaremos o efeito dos ácidos graxos na geração de ROS e ceramidas e o possível papel destes segundos mensageiros na ativação de proteínas relacionadas com a apoptose de neutrófilos. Será avaliado o efeito dos seguintes AG: ácidos graxos saturados palmítico e esteárico e o monoinsaturado oleico que são os mais abundantes na circulação, o ácido graxo poliinsaturado n-6 linoléico, que é o principal constituinte do óleo de soja e, portanto, muito abundante na dieta, e os ácidos graxos poliinsaturados n-3 eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA), os principais constituintes dos óleos de peixe que têm enorme aplicação terapêutica. Neutrófilos humanos serão previamente tratados com concentração não tóxica 100 µM e tóxica 200 µM do ácido esteárico; 250 µM dos ácidos oleico, linoleico, palmítico e DHA e 500 µM do ácido EPA. Estas concentrações são tóxicas para neutrófilos após 3 horas de incubação. Para verificar o tipo de morte (apoptose ou piroptose) serão avaliados através de citometria de fluxo os seguintes parâmetros: viabilidade, fragmentação de DNA, polaridade de membrana mitocondrial, externalização de fosfatidilserina e atividade da caspase 1. Os mecanismos envolvidos no processo de morte dos neutrófilos induzido por AG, serão avaliados, por western blotting e por PCR em tempo real. O efeito destes sobre a expressão das proteínas pró e antiapoptóticas (Bcl-xL, Bax e Bim) e sobre as vias de indução da morte extrínseca (caspase 8 e Bid) e intrínseca com participação da mitocôndria (citocromo c, Smac/Diablo, caspase 9 e caspase 3) e/ou estresse de retículo endoplasmático (CHOP, GRP78, PERK, pPERK, peIF2α e caspase 12) também será determinado. O efeito dos AG sobre a produção de ROS será avaliado por quimioluminescência utilizando lucigenina e Amplex™ red. A geração de ceramidas será analisada em HPLC com detector ELSD - (Evaporative Light Scattering Detector). A possível participação das ROS e ceramidas no processo de indução de apoptose pelos ácidos graxos será avaliada por citometria de fluxo na presença de antioxidantes (desferrioxamina e N- Acetilcisteina - NAC), e/ou na presença de inibidores da geração de ceramidas (Fumonisina B2, 3-0-metilesfingomielina e fantofarona). Esta parte do estudo também será estudada pela utilização de camundongos Knockout para gp91phox -/- e esfingomielinase -/-. Serão avaliados os seguintes parâmetros de morte celular por citometria de fluxo: viabilidade, fragmentação de DNA, externalização de fosfatidilserina e despolarização de membrana mitocondriaI. Neste estudo, também será avaliado o efeito de concentrações tóxicas de AG sobre a fosforilação das proteínas MAP quinases (p38 MAP-quinase, ERK 1/2 e JNK); o mesmo será feito na presença de agentes antioxidantes e inibi dores da síntese de ceramidas. (AU)