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Estudo das interações entre aminoácidos e ligantes na determinação das propriedades catalíticas das enzimas

Processo: 95/09307-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de fevereiro de 1997 - 30 de junho de 2003
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Ana Claudia Rasera da Silva
Beneficiário:Ana Claudia Rasera da Silva
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):00/09918-0 - Análise da afinidade dos subsítios de uma alfa-amilase de mutante de "Bacillus stearothermophilus", BP.IC
99/10464-5 - Mapeamento dos subsítios de interação entre alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri e o substrato., BP.DR
Assunto(s):Interação química  Aminoácidos  Ligantes  Enzimas  Proteínas 
Publicação FAPESP:http://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_109_114_114.pdf

Resumo

Os avanços técnicos na área de biologia molecular forneceram as ferramentas para a produção de proteínas com qualquer sequência desejada, permitindo o desenvolvimento de novas proteínas que atenderiam a necessidades especificas. Contudo, este grande potencial perde parte de sua aplicabilidade devido a nossa inabilidade de prever as características funcionais de uma proteína a partir de sua estrutura primária. Assim, deve-se primeiro entender como as interações entre os aminoácidos contribuem para a formação das propriedades funcionais e como essas interações determinam a especificidade para a ligação de outras moléculas para depois desenharmos novas proteínas. O objetivo principal deste projeto é estudar o papel das interações entre aminoácidos no mecanismo de especificidade biológica. Para alcançar este objetivo, pretende-se, utilizando experiência anterior em biologia molecular e engenharia de proteína, realizar mutações e produção de proteínas quiméricas com a finalidade de alterar a especificidade de uma enzima. As modificações serão baseadas em estudos comparativos entre as várias estruturas primárias e terciárias dos membros de uma família de enzimas. Como modelo experimental, escolheu-se trabalhar com a família das amilases, pelo fato de essa família atender aos seguintes pré-requisitos: a) variabilidade de especificidade para ligação de substrato e para reação; b) disponibilidade da estrutura cristalina de membros da família; c) clonagem e expressão em sistema heterólogo de alguns membros da família. Inicialmente, deseja-se estudar os determinantes estruturais das diferenças de especificidade entre as a-amilases produzidas por bacilos e as produzidas por fungos. Com base em estudos comparativos entre as estruturas tridimensionais da amilase de Bacillus licheniformis e do fungo Aspergillus oryzae (Taka-amilase), será modificada a estrutura da amilase de B. stearothermophilus com o intuito de entender como as diferenças estruturais afetam a sua especificidade. Outro projeto proposto é modificar o padrão de endo para exohidrolase da a-amilase de B.stearothermophilus baseado na estrutura cristalina da a-amilase P. stuzeri (exo-amilase) e de várias endo-aamilases já cristalizadas. Os mutantes serão produzidos em E. coli e analisados quanto ao tipo de produto formado durante a hidrólise do amido e aos seus parâmetros cinéticos. E, para aumentar a eficiência de expressão em sistemas heterólogos, pretende-se também, utilizando nossa experiência anterior com o sistema de chaperonas, desenvolver um sistema de expressão que coexpresse o complexo GroEL/GroES em conjunto com a proteína exógena. Dados anteriormente publicados mostraram que a coexpressão do complexo GroEL/GroES melhora a eficiência de expressão de proteínas exógenas em E. coli. (AU)