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Sinalização celular em melanócitos humanos normais e transformados: hormônios melanotrópicos e radiação ultravioleta

Resumo

A mudança de cor em mamíferos depende da proliferação celular e da produção de pigmentos em células especializadas, os melanócitos. As respostas são lentas e mediadas por uma cascata de eventos que regulam a diferenciação e a proliferação dos melanócitos. A célula pigmentar apresenta aspectos de grande interesse como modelo de diferenciação celular. No câncer, incluindo-se melanomas, os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciação celular são desregulados. O entendimento dos processos que causam essas perturbações é de fundamental importância não só para a terapêutica, como para o conhecimento dos mecanismos que embasam a proliferação celular e a expressão fenotípica em células normais. No presente projeto de pesquisa, nos propomos a avaliar os processos de diferenciação e proliferação celular modulados pelos hormônios melanotrópicos a-MSH, MCH, catecolaminas e melatonina, focalizando algumas vias de sinalização intracelular recrutadas pela ativação hormonal e UV, tanto em melanócitos normais como em linhagens de melanomas humanos. Em resposta a hormônios melanotrópicos associados ou não com radiação UVB, avaliaremos: 1 proliferação e diferenciação, esta evidenciada pela melanogênese, de melanócitos normais e transformados; 2. regulação do ciclo celular, pela análise da expressão e atividade de ciclinas, quinases associadas a ciclinas (CDKs) e inibidores dessas quinases (CKls, p21, p16 e p27), pRB e p53; 3. padrão de expressão de isoformas de PKC e PKA; 4. padrão de fosforilação de tirosina e serina/treonina de proteínas celulares, com a perspectiva de identificar substratos das vias de transdução de sinais desencadeadas por esses hormônios Utilizaremos culturas de melanócitos humanos normais e transformados, tratadas com a-MSH, MCH, catecolaminas (epinefrina e norepinefrina) e melatonina. O efeito desses hormônios na expressão fenotípica e na proliferação celular será avaliado, respectivamente, por determinação de atividade tirosinásica/conteúdo de melanina e de curvas de crescimento. A expressão de genes reguladores do ciclo celular (ciclinas, seus ativadores e inibidores, p53 e pRB) será avaliada por Northern blot, Western blot ou imunoprecipitação, dependendo da disponibilidade de anticorpos ou sondas específicas. Quando pertinente, a atividade dessas proteínas será analisada com ensaio de quinase. A caracterização de PKs será feita inicialmente pela identificação das isoformas expressas em melanócitos e melanomas. Serão construídos oligonucleotídeos degenerados a partir de regiões conservadas da proteína. Com esses oligonucleotídeos, pretendemos identificar, utilizando as técnicas de PCR e Northern blot, as formas de PKs existentes em melanócitos normais e transformados e a modulação dessa expressão por hormônios melanotrópicos. O padrão de fosforilação de proteínas celulares será avaliado por immunoblot com anticorpos anti Ptyr e Pser, ou por incorporação com fosfato inorgânico marcado radioativamente com 32P. As proteínas que se mostrarem diferencialmente fosforiladas devido ao tratamento com o hormônio serão purificadas por cromatografia de afinidade com anticorpos anti Ptyr ou Pser. A proteína purificada será submetida a immunoblot com anticorpos anti Pyr ou Pser para confirmação de que se trata de uma fosfoproteína e com outros anticorpos conhecidos, na tentativa de sua identificação. (AU)