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Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial

Processo: 97/06160-5
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de outubro de 1997 - 30 de novembro de 2001
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Célia Harumi Tengan
Beneficiário:Célia Harumi Tengan
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Auxílios(s) vinculado(s):99/06516-0 - Relationship of NADPH diaphorase activity and Type III mitric oxide synthase expression in skeletal muscle of patients with mitocondrial disorders, AR.EXT
Bolsa(s) vinculada(s):00/06569-5 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.TT
99/01527-3 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.TT
97/10423-1 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.JP
Assunto(s):DNA mitocondrial  Envelhecimento celular  Radicais livres 
Publicação FAPESP:http://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_176_149_150.pdf

Resumo

A principal alteração detectada em pacientes com uma doença mitocondrial é a deleção do DNAmt. A gênese desse rearranjo ainda não está esclarecida. Acredita-se que seja originada de recombinação anômala durante a replicação, favorecida por repetições diretas ou outras alterações, como sequências palindrômicas, genes de RNAt, alterações conformacionais por alta tensão helicoidal e radicais livres. Devido ao aparecimento de dois rearranjos (duplicação e deleção) num mesmo paciente, foi sugerido que o DNAmt duplicado seria um precursor do DNAmt deletado. No entanto, a real frequência da duplicação em pacientes com deleção do DNAmt ainda não está definida. As deleções podem ser encontradas, também, no envelhecimento normal, e sugere-se que seu aparecimento esteja relacionado à lesão por radicais livres provenientes da cadeia respiratória mitocondrial. Porém, em estudo anterior, verificou-se que pacientes com deficiência na cadeia respiratória, que teoricamente geraria mais radicais livres, não acumulam essa deleção de forma mais acelerada. O objetivo deste projeto é tentar elucidar os mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNAmt. Na primeira parte do trabalho, será analisada a presença de duplicação em pacientes com deleções do DNAmt por meio de Southern blotting e sequenciamento, e será realizada correlação genotípico-fenotípica. Na se gunda parte, se tentará melhorar a técnica do PCR longo para o diagnóstico de deleções do DNAmt em pacientes, o que facilitará o diagnóstico devido à facilidade técnica, à rapidez e não à necessidade de material radioativo. Na terceira parte, pretende-se verificar se pacientes com defeito na fosforilação oxidativa apresentam maior produção de radicais livres por meio de imunoistoquímica e Western blot de material proveniente de músculo, utilizando-se anticorpos contra SOD (Superoxido Dismutase) e NOS (Nitric Oxide Syntethase). Na quarta parte, será verificado o cérebro de ratos epilépticos (modelo experimental da pilocarpina) que apresentem aumento de SOD e NOS na fase aguda. Será analisada a presença de deleções do DNAmt (uma deleção específica pelo método quantitativo de diluições de múltiplas deleções pelo método de PCR longo) e proteínas mitocondriais (COX II e COX IV) por meio de imunoistoquímica e Western blot. Este estudo será realizado na fase crônica do modelo, ou seja, após três meses de indução do status epilético. Os resultados deste projeto poderão contribuir para o conhecimento da relação entre a duplicação e deleção do DNAmt, simplificar o diagnóstico das deleções do DNAmt e verificar se as deleções do DNAmt no envelhecimento realmente estão associadas com a lesão oxidativa. (AU)

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