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Expressão de genes associados à função mitocondrial e ao metabolismo de glicose e ácidos graxos em células musculares resistentes a insulina

Processo: 11/01877-8
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de agosto de 2011 - 31 de janeiro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Leonardo dos Reis Silveira
Beneficiário:Leonardo dos Reis Silveira
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Pesq. associados:Aníbal Eugênio Vercesi ; Antonio Carlos Boschiero ; Everardo Magalhães Carneiro ; Marcelo Damário Gomes ; Rui Curi
Assunto(s):Resistência à insulina  Diabetes mellitus  Mitocôndrias  Catalase  Espécies de oxigênio reativas  Sistema musculoesquelético  Ácidos graxos 

Resumo

A resistência a insulina é uma das principais características em indivíduos diabéticos. Embora o número de pesquisas nessa área tenha crescido exponencialmente, o mecanismo responsável pela instalação dessa patologia ainda não é totalmente conhecido. Porém, há consenso da existência de uma correlação entre resistência a insulina, inatividade e elevado conteúdo de lipídios intracelulares. Nessas condições, a capacidade mitocondrial é reduzida, seguido de elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Nossa proposta é de examinar o efeito da elevada capacidade antioxidante, induzida pela superexpressão da enzima catalase (CAT), responsável pelo controle dos níveis intracelulares de H2O2, na atividade mitocondrial, no consumo de substratos e na produção de EROs em células do músculo esquelético. Portanto, se um desequilíbrio do estado redox imposto pela elevada disponibilidade de ácidos graxos favorece a redução da atividade mitocondrial. Nossa hipótese é que, um aumento na indução da capacidade antioxidante poderá reverter esse quadro, aumentando o consumo de substratos. Em adição, testaremos a hipótese de que a expressão elevada das proteínas lançadeira glicerol-fosfato (LGF) e pivuvato carboxilase (PC) possam favorecer uma menor razão NAD+/NADH e maior consumo de substratos pelo ciclo do ácido tricarboxílico, respectivamente. Faremos isolamento e cultivo de células tronco, isoladas dos músculos inferiores de ratos. Após a transfecção com os respectivos plasmídios contendo to gene de interessa das proteínas listadas acima, as células serão tratadas com ácido graxo palmítico para indução de resistência a insulina. A produção de H2O2 será feita por fluorescência e a captação de glicose e metabolismo do ácido palmítico serão feitas por marcação radioativa. Western blotting e PCR em tempo real serão realizados para determinação do conteúdo de proteína e mRNA, respectivamente das proteínas de interesse: CAT, LGF e PC. Além de proteínas associadas ao metabolismo de glicose e ácidos graxos: PPAR² (indicador de lipólise), PGC1± e citrato sintase (indicadores de biogênese mitocondrial) e citrato liase (indicador de lipogênese) e Akt e PI3K (via de sinalização da insulina). Parâmetros bioquímicos incluindo consumo de oxigênio mitocondrial, razão NAD+/NADH e concentração dos intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico serão examinados. Como controle negativo, as variáveis acima serão avaliadas em células sob baixa expressão das proteínas de interesse pela técnica de siRNA. Os resultados in vitro serão posteriormente avaliados in vivo através do uso de animais transgênicos superexpressando as proteínas de interesse nesse estudo. (AU)

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