Produção de leptina recombinante bovina em levedura Pichia pastoris, avaliação da atividade biológica e efeito na maturação sexual de novilhas zebuínas

• Processo: 11/09752-0
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2014
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Zootecnia - Produção Animal
• Pesquisador responsável: Luis Felipe Prada e Silva
• Beneficiário: Luis Felipe Prada e Silva
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 11/18048-4 - Produção de leptina recombinante bovina em levedura Pichia pastoris, avaliação da atividade biológica e efeito na maturação sexual de novilhas zebuínas, BP.TT
• Assunto(s): Novilhos Reprodução animal Clonagem Expressão de proteínas Leptina Pichia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: expressão protéica | Hipotálamo | Leptina | Novilhas | Puberdade | Criação de animais

Resumo

A nutrição possui claro efeito sobre o desenvolvimento reprodutivo de bovinos, sendo a leptina indicada como possível elo entre nutrição e reprodução, sinalizando a condição corporal ao hipotálamo e exercendo efeito permissivo à obtenção da puberdade. Objetiva-se com este trabalho clonar a região codificadora da leptina bovina e produzir a proteína recombinante em levedura Pichia pastoris e avaliar o efeito da aplicação da leptina recombinante sobre a maturação sexual de novilhas zebuínas. A região codificante da leptina bovina será obtida através da amplificação por PCR de cDNA transcrito a partir de RNA extraído de amostras de tecido adiposo de novilhas Nelore. O gene será clonado em vetor de expressão e este inserido por eletroporação em bactéria Escherichia coli TOP10TM. Após seleção das colônias, os plasmídios serão isolados e seqüenciados para confirmação de que o enxerto está alinhado com a sequência sinalizadora de secreção. Cepas de P. pastoris serão transformadas por eletroporação para secreção de leptina no meio de cultura, sendo a leptina purificada por três fases de cromatografia, dializada e liofilizada. A leptina obtida será aplicada em quatro doses diferentes em 16 novilhas pré-púberes durante dois dias para determinação da dose adequada para experimentos de longo prazo. Trinta e seis novilhas Nelore pré-puberes serão utilizadas para testar a hipótese de que a elevação da concentração plasmática da leptina é capaz de induzir o início da puberdade em fêmeas Nelores. As novilhas serão distribuídas em três grupos: dieta de alta energia (A), dieta de baixa energia (B) e dieta de baixa energia com aplicação de leptina (BL). As novilhas serão monitoras duas vezes por semana quanto ao PV, escore da condição corporal, diâmetro do folículo dominante e presença de corpo lúteo, até o momento da primeira ovulação. A idade à puberdade será considerada como a idade à primeira detecção de um CL, comprovado como sendo funcional por dosagem sérica de progesterona maior que 1 ng/mml por duas coletas seguidas. (AU)