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Desenho racional de inibidores contra DHODH (diidroorotato desidrogenase): aplicações no tratamento da Doença de Chagas e no combate à praga do amarelinho

Processo: 01/14583-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
Vigência: 01 de julho de 2002 - 31 de agosto de 2007
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica
Pesquisador responsável:Maria Cristina Nonato Costa
Beneficiário:Maria Cristina Nonato Costa
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):05/58008-0 - Estudos cristalográficos da enzima diidroorotato desidrogenase de Trypanosoma Cruzi, BP.MS
04/16059-5 - Clonagem, expressão e purificação da enzima diidroorotato desidrogenase de Xylella fastidiosa-linhagem Temecula, BP.IC
04/14407-6 - Estudos cinéticos da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania major, BP.IC
04/12349-9 - Determinação da estrutura cristalográfica da enzima diidroorotato desidrogenase de Trypanosoma Cruzi em complexo com o produto da catálise, orotato, BP.IC
02/07032-0 - Desenho racional de inibidores contra DHODH (diidroorotato desidrogenase): aplicações no tratamento da Doença de Chagas e da praga do amarelinho, BP.JP
Assunto(s):Doença de Chagas  Trypanosoma cruzi  Pragas de plantas  Xylella fastidiosa  Inibidores enzimáticos  Cristalografia de proteínas 
Publicação FAPESP:http://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_94_104_105.pdf

Resumo

O presente projeto visa à determinação da estrutura cristalográfica e a modelagem de inibidores da enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) proveniente de dois diferentes organismos: Trypanosoma cruzi (TcDHODH), parasita causador da doença de Chagas, e Xylella fastidiosa (XfDHODH), uma bactéria fitopatogênica responsável pela “Praga do amarelinho”. DHODH pertence a um dos mais antigos processos metabólicos, a via de síntese de novo de nucleotídeo de pirimidinas, fundamental não somente na síntese de DNA e RNA, mas também em glicólise e biossíntese de lipídeos de membrana. DHODH atua no quarto passo dessa via metabólica e é responsável pela conversão de diidrorotato em orotato. DHODH utiliza o mononucleotídeo flavina (FMN, C17H21N4O9P1) como cofator, para promover a oxidação de diidroorotato, enquanto FMN é reduzido. A enzima DHODH foi identificada como sendo o alvo farmacológico de uma série de compostos químicos e naturais, tais como isoxazol, triazina, ácido cinchonicínico e derivados de quinona. Estes compostos interferem em reações descontroladas do sistema imune, auxiliam no combate de infecções parasitárias, como malária, e em terapias antivirais através da diminuição da concentração intracelular de nucleotídeos de pirimidinas. No presente momento, existe um grande interesse em investigar inibidores de DHODH como agentes terapêuticos no tratamento de doenças que envolvem grande proliferação celular e/ou parasitária. Neste contexto, o projeto propõe a modelagem racional de inibidores baseado na estrutura cristalográfica de dois novos membros das DHODHs: diidroorotato desidrogenase do parasita Trypanosoma cruzi (TcDHODH) e da bactéria Xylella fastidiosa (XfDHODH). A presença da via de biossíntese de novo de pirimidinas em ambos os organismos foi recentemente identificada e a inibição da mesma pode ser uma importante arma no combate à proliferação desses organismos patogênicos. Até o presente momento, as estruturas cristalográficas de dois membros dessa classe de proteínas foram determinadas: DHODH de Lactococcus lactis (LIOHODH) e DHODH humana (HsDHODH). Em termos gerais, as enzimas apresentam uma estrutura terciária similar. Uma diferença marcante entre as estruturas conhecidas é a região N-terminal, na qual, na enzima humana, existe um motivo adicional composto de duas hélices, responsável pela interação com a membrana mitocondrial e que se encontra ausente na estrutura de LIDHODH. Além do domínio de interação com a membrana, as enzimas humanas e bacterianas divergem quanto à forma de oligomerização. A LIDHODH é dimérica, enquanto a enzima humana é monomérica. Como consequência, diferenças são encontradas entre as duas estruturas e estão localizadas entre as regiões de interação entre os domínios catalíticos e de interação com a membrana e na região de contato entre os dois monômeros na enzima bacteriana. As etapas do projeto podem ser sumarizadas como segue: 1) Expressão de TcDHODH e XfHODH em E. coli e otimização das condições de purificação. As enzimas TcDHODH e XfDHODH foram recentemente clonadas em E. Coli. DNA genômico de T. cruzi foi gentilmente cedido pelo prof. dr. Otávio Thiemman, do Instituto de Física de São Carlos, USP de São Carlos, e o cosmídeo contendo o gene de DHODH de Xylella fastidiosa foi enviado pelo prof. Jesus Ferro, da Unesp de Jaboticabal, mediante um acordo assinado com a FAPESP. Ambas as enzimas serão expressas em E. coli usando um sistema de fusão com uma cauda de histidina (6xHis), uma construção similar à usada com sucesso na expressão de DHODH humana. A presença da cauda de histidina deverá facilitar a purificação da enzima; mas não podemos descartar a possibilidade da utilização de outras etapas de purificação, como foi necessária durante os experimentos de obtenção da enzima humana e de Plasmodium falciparum [resultados não publicados]. 2) Caracterização estrutural das enzimas TcDHODH e XfDHODH por meio das técnicas de difração de raios X em monocristais. Ensaios de cristalização serão realizados utilizando métodos de cristalização de macromoléculas convencionais, como difusão de vapor, microbatch, diálise e interface líquido-líquido. Análise da estrutura primária de XfDHODH sugere que esta possua o domínio de interação com a membrana e, como consequência, experimentos de cristalização em presença de detergente serão realizados. Os experimentos de difração de raios X a alta resolução serão realizados na linha de cristalografia de proteínas do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). As estruturas de ambas as enzimas TcDHODH e XfDHODH poderão ser resolvidas por meio da técnica de substituição molecular. TcOHOOH e XfDHOOH são altamente homólogas às enzimas LIDHODH e HsDHODH, respectivamente, cujas estruturas tridimensionais se encontram disponíveis no banco de dados de proteínas (http://www.rcsb.org). 3) Planejamento de inibidores específicos baseado em suas estruturas tridimensionais. Esta etapa do projeto será realizada utilizando diferentes abordagens: a) triagem de produtos naturais – colaboração da profa. dra Monica T. Puppo, do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, de Ribeirão Preto, USP; b) triagem utilizando a biblioteca de inibidores de DHODH de Plasmodium falciparum (PfDHODH) e DHODH humana (HsDHODH) – colaboração do prof. Jon Clardy, da Universidade de CorneII, EUA, que trabalha no estudo cristalográfico da enzima DHODH de Plasmodium falciparum (PfDHODH), agente causador da malária (projeto financiado pela Burroughs-Wellcome Fund), além da síntese de inibidores de PfDHODH; c) buscas ab initio de compostos de partida serão também realizadas mediante a utilização do programa DOCK; 4) modelagem e síntese de novos inibidores para XfDHODH e TcDHODH. Uma vez que potenciais inibidores sejam selecionados na etapa precedente, estes, chamados compostos de partida, deverão ser melhorados para aumentar sua capacidade inibitória e seletividade com relação ao seus alvos. A determinação da estrutura de XfDHODH e PfDHODH em complexo com estes compostos de partida, por meio de técnicas bem estabelecidas de cocristalização e soaking e a comparação com a estrutura da enzima humana permitirão a identificação de regiões e/ou diferenças estruturais a serem exploradas para a modelagem de inibidores específicos. A proposta de adição e/ou mudança de grupos químicos desses compostos de partida será feita em um trabalho interativo com pesquisadores do Departamento de Ciências Farmacêuticas da FCFRP-USP, para a viabilização da síntese de uma nova geração de inibidores específicos. É importante ressaltar que este projeto propõe a formação de um novo laboratório de cristalografia de proteínas e desenho de fármacos baseado em estrutura no Estado de São Paulo. O campus da USP de Ribeirão Preto apresenta todas as características essenciais para a formação de um novo centro nessa área de pesquisa, com destaque tanto para o seu alto grau de interdisciplinaridade, caracterizado por unidades de pesquisa nas áreas de física, química, biologia e ciências médicas, quanto pela tradição em ciências farmacêuticas, dentro da qual os objetivos específicos do presente trabalho se encaixam. A presença do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, com uma linha dedicada exclusivamente à cristalografia de proteínas, e a existência do conhecimento gerado pela primeira etapa do sequenciamento, aliados à biodiversidade de produtos naturais existentes no Brasil, faz com que tenhamos a infraestrutura ideal para este tipo de projeto. A proposta visa a um uso extenso da tecnologia e conhecimento disponíveis para o estudo de problemas nacionais e dá continuidade à caracterização da bactéria Xylella fastidiosa, iniciada com o pioneiro trabalho de sequenciamento do seu genoma. (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
PINHEIRO, MATHEUS PINTO; EMERY, FLAVIO DA SILVA; CRISTINA NONATO, M. Target Sites for the Design of Anti-trypanosomatid Drugs Based on the Structure of Dihydroorotate Dehydrogenase. CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, v. 19, n. 14, p. 2615-2627, APR 2013. Citações Web of Science: 17.
CORDEIRO, ARTUR T.; FELICIANO, PATRICIA R.; PINHEIRO, MATHEUS P.; CRISTINA NONATO, M. Crystal structure of dihydroorotate dehydrogenase from Leishmania major. Biochimie, v. 94, n. 8, p. 1739-1748, AUG 2012. Citações Web of Science: 21.
COUTO‚ S.G.; NONATO‚ M.C.; COSTA-FILHO‚ A.J. Defects in vesicle core induced by Escherichia coli dihydroorotate dehydrogenase. BIOPHYSICAL JOURNAL, v. 94, n. 5, p. 1746-1753, 2008.

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