Estudo molecular de proteínas moduladoras da polimerização da FtsZ e seu papel no controle da divisão celular bacteriana

• Processo: 02/10616-4
• Linha de fomento: Auxílio à Pesquisa - Apoio a Jovens Pesquisadores
• Vigência: 01 de julho de 2003 - 31 de dezembro de 2008
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Frederico José Gueiros Filho
• Beneficiário: Frederico José Gueiros Filho
• Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 08/57615-9 - Estrutura e mecanismos de mciz, um capeador da extremidade menos de ftsz em bacillus subtilis, BP.DR; 05/58883-9 - Estudo da funcao das proteinas mincd e spoiie na formacao do septo polar durante a esporulacao em bacillus subtilis., BP.DR; 04/13852-6 - Estudo da funcao das proteinas ftsa e zapa na formacao do anel z durante a divisao celular em bacillus subtilis., BP.PD; 03/04525-9 - Estudo molecular de proteínas moduladoras da polimerização da FtsZ e seu papel no controle da divisão celular bacteriana, BP.JP
• Assunto(s): Divisão celular Polimerização Bactérias
• Publicação FAPESP: http://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_166_144_145.pdf

Resumo

A etapa-chave da formação do septo de divisão em bactérias é a polimerização da proteína FtsZ, a tubulina procariótica, em uma estrutura chamada anel Z. É o anel Z que define onde e quando o novo septo será formado e sua formação é decorrência tanto da tendência intrínseca da FtsZ de polimerizar-se como da ação de proteínas moduladoras capazes de estimular ou inibir a polimerização da FtsZ. Recentemente, foi usada uma estratégia genética para identificar um novo modulador da formação do anel Z, que batizamos de ZapA. ZapA é uma proteína de 85 aminoácidos que se localiza no complexo de divisão e exerce um efeito positivo na formação do anel Z. Estudos bioquímicos iniciais demonstraram que ZapA é capaz de interagir com FtsZ diretamente e promover a sua autoassociação em polímeros complexos. A identificação e a caracterização inicial de ZapA propiciam o entendimento do processo de formação do anel Z. Ao mesmo tempo, geram questões importantes a respeito do mecanismo de ação desses fatores e sobre a possibilidade de que existam outros moduladores da FtsZ que ainda não foram descobertos. Só a partir do entendimento detalhado de como é controlada a formação do anel Z se poderá desvendar os mecanismos de regulação espaço-temporal da divisão celular bacteriana. Nesse sentido, será importante expandir o conhecimento das proteínas que são capazes de modular a formação do anel Z, assim como investigar os mecanismos pelos quais elas exercem seus efeitos. Assim, o projeto proposto apresenta os seguintes objetivos: 1) aprofundamento do estudo molecular da função de ZapA; 1.1) estudo da relação estrutura-função em ZapA; 1.2) estudo da regulação da expressão e atividade de ZapA ao longo do ciclo celular; 2) identificação sistemática de novas proteínas moduladoras da polimerização da FtsZ em B. subtilis, por meio de abordagens exaustivas e complementares; 3) estudo molecular das novas proteínas moduladoras da polimerização de FtsZ que venham a ser descobertas em decorrência do objetivo (2). A investigação da relação estrutura-função de ZapA será executada por meio da criação de mutantes sítio-dirigidos e posterior análise de sua funcionalidade em dois tipos de ensaios. Um dos ensaios usará fusões a GFP e microscopia de fluorescência para determinar a capacidade de localização das proteínas mutantes. O segundo ensaio determinará se os diferentes mutantes ainda são capazes de promover a formação do anel Z e suprimir o fenótipo causado pela superexpressão de um inibidor de divisão. Para determinar se expressão e atividade de ZapA são reguladas durante o ciclo celular, será usada uma abordagem citológica, novamente baseada em fusões entre ZapA e GFP. A expressão de ZapA ao longo do ciclo celular deverá corresponder à fluorescência produzida pela porção GFP da fusão GFP-ZapA e será monitorada por microscopia quantitativa. Evidências de um controle no nível da atividade da proteína serão buscadas em experimentos de colocalização de ZapA e FtsZ ao longo do ciclo celular. Para esses experimentos, ZapA e FtsZ serão fundidas a variantes espectrais de GFP e o padrão de localização das duas proteínas será determinado simultaneamente em uma mesma célula. A existência de um período do ciclo celular no qual as proteínas não se colocalizam indicará que a interação entre elas não é sempre permitida e que moduladores positivos podem ter sua atividade regulada. Para a identificação de novas proteínas moduladoras da FtsZ, propõe-se a adoção de quatro abordagens, baseadas em estratégias genéticas, bioquímicas e de duplo-híbrido independentes. As estratégias genéticas incluem uma triagem para genes supressores do bloqueio de divisão causado por um alelo FtsZ sensível à temperatura e uma triagem para mutações letais sintéticas quando em combinação com mutação em ZapA. A estratégia bioquímica consistirá em identificar proteínas que copurifiquem com polímeros de FtsZ isolados de extratos proteicos totais. Finalmente, usaremos FtsZ como “isca” em um sistema duplo-híbrido em bactérias para tentar identificar parceiras da FtsZ a partir de bibliotecas de B. subtilis criadas no vetor “presa”. Prevê-se que o uso de abordagens diversas e complementares permita a amostragem exaustiva desses fatores no genoma/proteoma de B. subtilis. Estudos moleculares semelhantes aos propostos para ZapA serão então realizados para os novos moduladores que venham a ser identificados. Além do conhecimento básico gerado, espera-se que a identificação e a caracterização de novos moduladores da FtsZ também possam criar oportunidades para o desenvolvimento de novos antibióticos. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

DE SOUZA, ROBSON FRANCISCO; ANANTHARAMAN, VIVEK; DE SOUZA, SANDRO JOSE; ARAVIND, L.; GUEIROS-FILHO, FREDERICO J. AMIN domains have a predicted role in localization of diverse periplasmic protein complexes. Bioinformatics, v. 24, n. 21, p. 2423-2426, NOV 1 2008. Citações Web of Science: 7.