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Cloning approach and Functional Analysis of anti-intimin single-chain variable fragment (scFv) abordagens de clonagem e análise funcional de um fragmento fragmento variável de cadeia única(scFv) anti-intimina

Processo: 11/01245-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
Vigência: 01 de março de 2011 - 31 de agosto de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Roxane Maria Fontes Piazza
Beneficiário:Roxane Maria Fontes Piazza
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Análise funcional  Clonagem  Anticorpos monoclonais  Proteínas recombinantes  Técnicas de diagnóstico molecular 

Resumo

Intimina é um importante fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). Ambos ainda são considerados como importantes agentes causadores de diarreia em muitos paises em desenvolvimento e industrializados. Considerando que anticorpos são importantes ferramentas na detecção de vários patógenos, previamente nós obtivemos um anticorpo monoclonal IgG2b contra a região conservada (int388-667) da molécula de intimina. Por immunoblotting, este monoclonal mostrou uma excelente especificidade. Apesar do bom desempenho, este monoclonal não detectou alguns isolados de EPEC e EHEC que apresentam variações de aminoácidos na região 338-667 da molécula de intimina. Consequentemente, motivado pelo seu uso em diagnóstico, neste estudo nós clonamos e expressamos a fração variável de cadeia única deste anticorpo monoclonal (scFv). O RNAm do hibridoma anti-intimina foi extraído e reversamente transcrito para cDNA, as cadeias leves e pesadas da fração variável do anticorpo foram amplificadas usando iniciadores comerciais. As cadeias amplificadas foram clonadas em vetor pGEM-T Easy. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados na amplificação e na estratégia de ligação, obtendo assim o scFv, que foi em seguida clonado no vetor pAE. A cepa E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmideo pAE scFv-intimina e submetido a indução para expressão da proteína. O scFv anti-intimina foi expresso em corpúsculos de inclusão (fração insolúvel), o qual foi denaturado, purificado e submetido ao re-enovelamento. O rendimento protéico foi de 1 mg de proteína em 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv foram realizados ensaios de ELISA e imunofluorescência, demonstrando que 275 ng de scFv reagiu com 2 mg de intimina purificada, resultando em uma absorbância de 0.75 a 492 nm. O ensaio de imunofluorescência mostrou uma forte reatividade com EPEC E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina é capaz de reconhecer a região conservada da intimina (Int388-667) na forma purificada e cepa de EPEC. (AU)