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Bases moleculares dos relógios biológicos: expressão circadiana de enzimas envolvidas em atividades diurnas das algas unicelulares Gonyaulax polyedra e Pyrocystis lunula

Processo: 92/00347-2
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de maio de 1992 - 31 de outubro de 1996
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Pio Colepicolo Neto
Beneficiário:Pio Colepicolo Neto
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Relógios biológicos  Enzimas  Nitrato redutase  Algas  Dinoflagelados 

Resumo

O objetivo em longo prazo deste projeto é elucidar os mecanismos bioquímicos e celulares responsáveis pelos ritmos endógenos diários (circadiano). Estes ritmos persistem sob condições constantes de luz e temperatura por várias semanas. Para nosso estudo, elegemos o dinoflagelado Gonyaulax polyedra sobre o qual há volumosa contribuição de diversos pesquisadores da área de cronobiologia. Esta célula tem a expressão circadiana de sua bioluminescência, divisão celular, fotossíntese e motilidade controlados pelo relógio biológico. Experimentos preliminares recentes de nosso trabalho têm mostrado que diversas enzimas de G. polyedra variam suas atividades circadianamente. Uma dessas essas enzimas é a nitrato redutase (NaR) a qual está intimamente conectada à fotossíntese. Sua expressão ocorre exclusivamente no período diurno, mais precisamente às 14h00min (CT: 08), Recentemente isolamos e caracterizamos a NaR de G. polyedra e após sua purificação preparamos em coelhos anticorpos policlonais (abNaR) contra a mesma. O anticorpo mostrou ser extremamente eficiente no reconhecimento das subunidades da proteína. De posse de abNaR teremos condições de dar continuidade as seguintes etapas de trabalho: 1) determinação da existência ou não da oscilação protéica de NaR, similar a atividade específica, dentro de um período circadiano por técnicas de 'Westem blots'; 2) imunolocalização intracelular de NaR por técnicas de imunofluorescência; 3) isolamento periódico do RNA total e purificação por afinidade do RNA mensageiro de Gonyaulax e 4) construiremos o cDNA library do período diurno e clonaremos NaR utilizando abNaR e oligonucleotídeos sintéticos de domínio flavínico e do Heme. Conseqüentemente, analisaremos os níveis de controle da mensagem para NaR. Simultaneamente experimentos semelhantes estarão sendo feitos com a alga marinha Pyrocystis lúnula. Paralelamente estaremos desenvolvendo estudos sobre a enzima superóxido dismutase (SOD) a qual apresenta em Gonyaulax atividade máxima também no período do diurno. Recentemente mostramos que nestas células a SOD tem um perfil de expressão semelhante à fotossíntese e atividade de NaR Informações a respeito da regulação circadiana de NaR e de SOD, proteínas de expressão diurna, nos possibilitará avaliar como o relógio biológico atua no controle alternativo e/ou simultâneo de atividades periódicas. (AU)