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Papel de aminoácidos do sítio ativo e da interface oligomérica na estrutura e função da nucleosídeo difosfato kinase de Leishmania major

Resumo

A nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) é uma enzima responsável pela produção de nucleosídeos trifosfatados e está envolvida com vários processos celulares. A NDKb é secretada no meio extracelular e considerada um fator de patogenicidade em patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae e L. amazonensis. Este projeto tem por objetivo caracterizar a atividade cinética da enzima recombinante nucleosídeo difosfato kinase b (NDKb) de L. major e avaliar o efeito de mutações no sítio ativo e na interface oligomérica, relacionando as alterações na estrutura com a atividade catalítica e funcional da enzima. Mutações sítio-dirigidas foram realizadas e testes de expressão mostraram que os mutantes foram produzidos em E. coli e serão purificados e caracterizados nesse projeto. A caracterização cinética com doadores de fosfato está em andamento no laboratório e, nesse projeto, serão obtidos os parâmetros cinéticos com nucleotídeos doadores e aceptores de fosfato da proteína recombinante selvagem e dos mutantes, via análise cromatográfica, usando HPLC, dos produtos da reação. Estudos de estrutura em solução de dicroísmo circular, de fluorescência intrínseca do triptofano e de filtração em gel e SAXS serão realizados para a avaliação da estabilidade da estrutura secundária, terciária e quaternária da NDKb nativa e mutantes. A exposição de proteínas secretadas a vários ambientes, inclusive com alterações no pH, justificam os diferentes experimentos com variação de pH para analisar as mudanças estruturais e de atividade da NDK, durante o ciclo de vida do parasita. Com fluorescência, serão avaliadas a supressão e anisotropia de fluorescência intrínseca, que informam sobre o acesso de supressores e do movimento da estrutura, permitindo inferências sobre a estrutura nos diferentes ambientes de pH e agentes desnaturantes. Ainda, com dicroísmo circular, será obtido o perfil por desnaturação térmica, por agentes caotrópicos e por variação de pH, com o intuito de verificar alterações na estrutura secundária e terciária desses mutantes. A estrutura quaternária será analisada por filtração em gel e SAXS para analisar o efeito das mutações no perfil de oligomerização, analisado com agentes caotrópicos e com variação de pH. Os efeitos dessas mutações na LmNDKb serão correlacionados com uma abordagem funcional, com experimentos de citotoxicidade e invasão macrófagos na presença proteínas mutantes e, após a obtenção de parasitas superexpressando as NDKs mutantes, será analisada a virulência de patas de camundongo e a invasão de macrófagos. Assim, com esses resultados pretende-se correlacionar o papel de regiões da NDK na manutenção estrutura e atividade catalítica com as ações da NDKb na do parasita com o hospedeiro. (AU)

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Publicações científicas (4)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
VIEIRA, PLINIO SALMAZO; CAMPOS BRASIL SOUZA, TATIANA DE ARRUDA; HONORATO, RODRIGO VARGAS; ZANPHORLIN, LETICIA MARIA; SEVERIANO, KELVEN ULISSES; ROCCO, SILVANA APARECIDA; CAVALCANTE DE OLIVEIRA, ARTHUR HENRIQUE; CORDEIRO, ARTUR TORRES; LOPES OLIVEIRA, PAULO SERGIO; DE GIUSEPPE, PRISCILA OLIVEIRA; et al. Pyrrole-indolinone SU11652 targets the nucleoside diphosphate kinase from Leishmania parasites. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 488, n. 3, p. 461-465, . (07/06755-2, 11/24178-8, 10/51730-0, 10/03761-4, 11/20569-2)
VIEIRA, PLINIO SALMAZO; DE GIUSEPPE, PRISCILA OLIVEIRA; CAVALCANTE DE OLIVEIRA, ARTHUR HENRIQUE; MURAKAMI, MARIO TYAGO. The role of the C-terminus and Kpn loop in the quaternary structure stability of nucleoside diphosphate kinase from Leishmania parasites. Journal of Structural Biology, v. 192, n. 3, p. 336-341, . (07/06755-2, 11/24178-8, 10/51730-0, 10/03761-4, 11/20569-2)
LIMA, JULIANA MARIA; VIEIRA, PLINIO SALMAZO; CAVALCANTE DE OLIVEIRA, ARTHUR HENRIQUE; CARDOSO, CARMEN LUCIA. Label-free offline versus online activity methods for nucleoside diphosphate kinase b using high performance liquid chromatography. ANALYST, v. 141, n. 15, p. 4733-4741, . (11/20569-2, 14/06907-0, 13/01710-1)
VIEIRA, PLINIO S.; DE JESUS SANTOS, ANA P.; DE OLIVEIRA, ARTHUR H. C.. Biophysical Characterization of the Nucleoside Diphosphate Kinase of Leishmania major and Effect of the P95S Mutation. PROTEIN AND PEPTIDE LETTERS, v. 23, n. 2, p. 99-106, . (11/20569-2, 07/06755-2, 10/03761-4)

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