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Estratégias analíticas para a triagem e determinação do triptofano e seus metabólitos em cultura de células de glioma humano

Processo: 12/05198-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de junho de 2012 - 30 de novembro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Analítica
Pesquisador responsável:Ernani Pinto Junior
Beneficiário:Ernani Pinto Junior
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Pesq. associados:Ana Campa ; Ariane Rivellis Júlio ; Fabyana Maria dos Anjos
Assunto(s):Cromatografia líquida de alta eficiência  Metabólitos  Neoplasias neuroepiteliomatosas  Glioma  Triptofano 

Resumo

Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento de métodos bioanalíticos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) bidimensional para a determinação quantitativa e simultânea dos metabólitos do triptofano (TRP), incluindo aqueles das vias das quinureninas (via KYN), serotoninérgica (via SER) e das triptaminas (incluindo dimetiltriptamina, DMT). Serão utilizados diferentes tipos de detecção: (i) por arranjo de diodos (DAD), (ii) fluorescência (FD) e (iii) espectrometria de massas (MS). A validação dos métodos seguirá as especificações da Resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA. Como matriz biológica, serão utilizadas culturas celulares de gliomas da linhagem A172. Além do desenvolvimento de métodos utilizando cromatografia bidimensional para a detecção simultânea dos analitos de interesse, métodos de extração também serão otimizados para a concentração dos metabólitos presentes nos sobrenadantes e homogenatos celulares. A investigação do catabolismo do TRP e formação de metabólitos são de grande relevância, pois vários dos compostos presentes nessas vias atuam sobre processos de imuno escape de tumores, tolerância e imunomodulação. A confirmação da presença de alguns dos metabólitos e determinação de suas concentrações em fluidos biológicos pode ser de grande valia para o prognóstico de diversas doenças. Adicionalmente, resultados recentes do grupo colaborador (Laboratório de Bioquímica Clínica FCF-USP) evidenciam que há um cross-talking entre as vias de metabolização do TRP e que vários outros metabólitos afetam o crescimento de tumores. Desta forma, há interesse no desenvolvimento de metodologias analíticas seletivas e sensíveis para acompanhar e evidenciar a formação dos produtos do metabolismo do TRP. Para que as vias sejam evidenciadas, será utilizado TRP marcado com isótopos estáveis (13C e deutério - D) em diferentes posições em sua estrutura e os produtos serão monitorados por LC-MS/MS (Ion trap e Q-TOF). A escolha da linhagem de glioma A172 é em razão das rotas de catabolismo do TRP, via KYN e via das triptaminas, estarem ativas nestas células, o que a torna uma excelente matriz para o desenvolvimento do método. Além disso, a via KYN, conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO), é intensamente aumentada na presença de interferon gama (IFN-g). Essa linhagem oferece condições adequadas para o desenvolvimento de novos métodos bioanalíticos seletivos, robustos e sensíveis para o estudo da metabolização de TRP. (AU)