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Estudo do papel de microRNAs nos efeitos biológicos de TGF-beta1 em fibroblastos de polpa dental humana e em tecido pulpar de camundongos

Processo: 12/11620-7
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de fevereiro de 2013 - 31 de julho de 2015
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Endodontia
Pesquisador responsável:Sandra Helena Penha de Oliveira
Beneficiário:Sandra Helena Penha de Oliveira
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia (FOA). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araçatuba. Araçatuba , SP, Brasil
Assunto(s):Polpa dentária  Fatores de crescimento de fibroblastos  MicroRNAs  Inativação gênica  Hibridização in situ  Matriz extracelular 

Resumo

O tecido pulpar é persistentemente afetado por impactos ambientais durante a vida humana. A capacidade de reparo da polpa dental é limitada e os mecanismos envolvidos neste fenômeno não são completamente compreendidos. MicroRNAs são moléculas responsáveis pela regulação fina da síntese protéica e podem estar envolvidos no processo de reparo pulpar. Este estudo tem como objetivo investigar o papel de microRNAs no reparo da polpa dental. Cultura primária de fibroblastos de polpa dental humana serão estabelecidos a partir de terceiros molares hígidos (n=3). Os fibroblastos serão tratados com concentrações crescentes de TGF-b1 por 6, 24 e 72h para análise e validação da expressão dos microRNAs miR-144 e da família let-7. Com base nestes resultados, o silenciamento dos miRNAs expressos será realizado utilizando-se ácidos nucléicos estabilizados (Locked Nucleic Acid) e as células serão tratadas com TGF-b1 na concentração e tempo determinados anteriormente. A avaliação de alvos candidatos a interação com os microRNAs supracitados serão avaliados por RT-PCR (reação em cadeia da polimerase seguida de transcrição reversa) e a detecção das proteínas será realizada por Citometria de fluxo (Fibronectina, b8 integrina, b3 integrina, ±3 integrina e TGFBRI), Western blot (colágeno 1A1, 1A2, colágeno 3, fibrilina 1 e Smad4) e ELISA (trombospondina-1 e p-SMAD2/3). A marcação de diferenciação em miofibroblastos e odontoblastos-like será feita por imunofluorescência para actina de músculo liso e proteína de matriz dentinária 1. As células silenciadas e controle serão avaliados ainda quanto à proliferação e ciclo celular. Para avaliar a expressão de microRNAs durante o reparo da polpa dental, camundongos Balb/c serão tratados com um inibidor de TGFBRI (SB-431542) e submetidos à indução de exposição pulpar e capeamento direto com agregado trióxido mineral (MTA). Após 1, 2, 3 e 4 semanas, os animais serão eutanaziados e espécimes serão coletados para deteção dos microRNAs alvo por meio de hibridização in situ. Com base nos resultados dos ensaios in vitro e do ensaio de hibridização in situ, será realizado o silenciamento de miRNAs in vivo. Camundongos Balb/c serão tratados com inibidor de microRNA e submetidos à lesão pulpar como descrito anteriormente. Após quatro semanas, os animais serão eutanasiados e o reparo da polpa dental será avaliado histologicamente por coloração de hematoxilina e eosina e tricrômio de Masson. (AU)

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