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Uso de Aptâmeros de DNA para a substituição de proteína a na purificação industrial de anticorpos monoclonais (mAbs)

Resumo

Durante a purificação de anticorpos terapêuticos, impurezas como proteínas da célula hospedeira, DNA, pequenas moléculas, endotoxinas e partículas virais precisam ser removidas. Atualmente, a coluna de afinidade a Proteína A é o procedimento rotineiramente usado na purificação de anticorpos a partir de soluções complexas, assim como o meio de cultura celular, pois se liga a porção Fc de uma variedade de moléculas IgG de mamíferos. No entanto, o processo de purificação industrial de anticorpos monoclonais (MAbs) utilizando a Proteína A possui desvantagens que ainda não foram superadas, apesar vários ligantes sintéticos terem sido propostos para a substituição da Proteína A na cromatografia de afinidade. Visto que, a Proteína A, além de ter um alto custo, pode ser imunogênico ao ser humano em caso de contaminação no processo industrial. O presente projeto tem como objetivo selecionar aptâmeros de DNA com alta especificidade e afinidade e especificidade contra a porção Fc da imunoglobulina G humana (IgG-Fc) e testar a viabilidade técnica na purificação de MAbs para fins terapêuticos. Aptâmeros são pequenas moléculas de oligonucleotídeos de DNA ou RNA selecionados para serem capazes de ligar com alta afinidade e especificidade a quaisquer alvos de interesse farmacêutico e biológico. A ampla variedade de aplicações tais como diagnóstico e purificação de biomoléculas tornam possível prever que a aplicação de aptâmeros seja notável na indústria farmacêutica num futuro breve. Desenvolveremos os aptâmeros de DNA contra IgG-Fc utilizando a técnica de SELEX padronizada pelo Prof. Henning Ulrich, IQ-USP (membro da equipe técnica). Aptâmeros de DNA possuem vantagens em relação ao RNA, pois são baratos e modificações são facilmente conseguidas por PCR usando primers (iniciadores) modificados. As misturas dos aptâmeros selecionados serão clonadas, seqüenciadas e caracterizadas em relação as suas afinidades e especificidade de ligação a IgG-Fc. Posteriormente, os aptâmeros de mais alta afinidade serão modificados por acoplagem de um resíduo de biotina no terminal 5. Os aptâmeros biotinilados serão imobilizados em sefarose-estreptavidina e utilizados para a purificação de MAbs por cromatografia de afinidade. Esta série de experimentos representaria uma prova de princípio da utilização de aptâmeros para purificação de MAbs no processo industrial. Caso esta prova de princípio seja bem sucedida, deveremos também contar com a colaboração do Laboratório, Cristália na preparação do aptâmero para aplicação industrial. (AU)