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Avaliação da eficácia do método de sequenciamento de nova geração na análise dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1)

Processo: 13/19810-2
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de janeiro de 2014 - 31 de dezembro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Delmar Muniz Lourenço Jr
Beneficiário:Delmar Muniz Lourenço Jr
Instituição-sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Pesq. associados:Alexander Augusto de Lima Jorge ; Sueli Mieko Oba Shinjo ; Suely Kazue Nagahashi Marie
Bolsa(s) vinculada(s):15/07625-1 - Avaliação da eficácia do método de sequenciamento de nova geração na análise dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27kip1 e AIP em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1), BP.TT
Assunto(s):Endocrinologia  Síndromes neoplásicas hereditárias  Neoplasia endócrina múltipla tipo 1  Mutação  Análise de sequência de DNA  Sequenciamento de nova geração 

Resumo

A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide, pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). Outros genes foram, recentemente, relacionados a MEN1 (CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP). O diagnóstico genético de famílias com MEN1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação em MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbi-mortalidade relacionada à MEN1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de MEN1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger, contemplando, a princípio, somente o gene MEN1. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 600 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de "hot spots" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (9Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Soma-se a isso a necessidade de estender o estudo gênico para os genes acima citados quando a análise do gene MEN1 é negativa. Uma vez que as limitações da técnica de Sanger também dificultam a análise destes genes, há a inviabilização da incorporação do diagnóstico gênico completo de MEN1 na prática clínica. O NGS (New Generation Sequencing) é uma nova ferramenta de sequenciamento genético que detêm maior capacidade e velocidade de geração de dados e maior cobertura de leitura gênica, incluindo regiões promotoras, intrônicas e regulatórias. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em MEN1. Os objetivos são: validação da técnica de NGS (Illumina MiSeq) utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação de aspectos qualitativos e relação custo-benefício do NGS abrangendo o gene MEN1 e os demais genes recentemente relacionados a síndrome; excluir, por MLPA, grandes deleções germinativas MEN1 não encontradas por Sanger e NGS. Para tal, serão analisados 50 casos-índices com MEN1. Em avaliação preliminar, utilizando Ion PGM, foram analisados 4 casos-índices com mutação germinativa previamente conhecida no gene MEN1. Foi obtida uma cobertura média de leitura > 100x, com 100% da região alvo (gene MEN1) com no mínimo 10 reads, permitindo a avaliação com acurácia de todas as mutações germinativas. Também, foi encontrada uma média de 37 SNPs por paciente. Entretanto, inúmeros in/dels foram gerados dificultando a análise dos resultados. Este grande número de in/dels é causado por uma limitação específica da plataforma Ion PGM. Diante disto, optou-se pelo uso da plataforma Illumina MiSeq pela análise dos dados gerados serem fornecidos na própria plataforma, não resultar na geração de falsos in/dels e devido a menor probabilidade de erros frente às sequencias ricas em C-G, comuns no gene MEN1. O enriquecimento da amostra será realizado por meio de "long range PCR" que amplificará toda a região genômica dos genes MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP. Este projeto pretende, assim, introduzir o NGS como ferramenta de diagnóstico gênico de MEN1 em nosso meio. (AU)

Publicações científicas (4)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DANTAS, NAIARA C. B.; SOARES, CARLOS E. L.; MARTINS, MANOEL R. A.; LOURENCO, JR., DELMAR M.; QUIDUTE, ANA R. P. Giant Prolactinoma Causing Hydrocephalus and Intracranial Hypertension as First Manifestations of Multiple Endocrine Neoplasia Type 1. FRONTIERS IN ENDOCRINOLOGY, v. 10, AUG 28 2019. Citações Web of Science: 0.
CARVALHO, RAFAEL A.; URTREMARI, BETSAIDA; JORGE, ALEXANDER A. L.; SANTANA, LUCAS S.; QUEDAS, ELISANGELA P. S.; SEKIYA, TOMOKO; LONGUINI, VIVIANE C.; MONTENEGRO, FABIO L. M.; LERARIO, ANTONIO M.; TOLEDO, SERGIO P. A.; MARX, STEPHEN J.; TOLEDO, RODRIGO A.; LOURENCO JR, DELMAR M. Germline mutation landscape of multiple endocrine neoplasia type 1 using full gene next-generation sequencing. EUROPEAN JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, v. 179, n. 6, p. 391-407, DEC 2018. Citações Web of Science: 3.
RODRIGUES, KARINE C.; TOLEDO, RODRIGO A.; COUTINHO, FLAVIA L.; NUNES, ADRIANA B.; MACIEL, RUI M. B.; HOFF, ANA O.; TAVARES, MARCOS C.; TOLEDO, SERGIO P. A.; LOURENCO, JR., DELMAR M. Assessment of Depression, Anxiety, Quality of Life, and Coping in Long-Standing Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 Patients. THYROID, v. 27, n. 5, p. 693-706, MAY 2017. Citações Web of Science: 6.
TOLEDO, SERGIO P. A.; LOURENCO, JR., DELMAR M.; SEKIYA, TOMOKO; LUCON, ANTONIO M.; BAENA, MARCOS E. S.; CASTRO, CLAUDIO C.; BORTOLOTTO, LUIZ A.; ZERBINI, MARIA C. N.; SIQUEIRA, SHEILA A. C.; TOLEDO, RODRIGO A.; DAHIA, PATRICIA L. M. Penetrance and Clinical Features of Pheochromocytoma in a Six-Generation Family Carrying a Germline TMEM127 Mutation. JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY & METABOLISM, v. 100, n. 2, p. E308-E318, FEB 2015. Citações Web of Science: 22.

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