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A função do gene AIRE e de micro RNAs no controle da adesão de células tímicas epiteliais medulares com timócitos

Processo: 13/17481-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de abril de 2014 - 31 de março de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Geraldo Aleixo da Silva Passos Júnior
Beneficiário:Geraldo Aleixo da Silva Passos Júnior
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto, SP, Brasil
Pesq. associados:Silvana Giuliatti
Assunto(s):Genética molecular  Expressão gênica  Timo  MicroRNAs  Transcriptoma  Timócitos 

Resumo

O timo desempenha seu papel na indução da tolerância imunológica central aos antígenos relacionados aos tecidos próprios (TRAs) sendo que na medula desse órgão, nas células tímicas medulares epiteliais (mTECs) ocorre a expressão de centenas desses TRAs que, por sua vez, representam virtualmente todos os órgãos e tecidos do corpo. Devido à diversidade de representação, este fenômeno foi chamado de expressão gênica promíscua (PGE) a qual é em grande parte controlada pelo gene Autoimmune regulator (Aire). A seleção negativa de timócitos auto reativos é essencial para que ocorra a tolerância imunológica. Os timócitos oriundos da medula óssea migram para o timo e na medula desse órgão, interagem com as células mTEC que expressam os TRAs (adesão mTECs-timócitos). Os clones de timócitos que reconhecem com avidez os TRAs apresentados pelas mTECs via MHC-II são então eliminados por apoptose (seleção negativa). Como o gene Aire controla parte da PGE/TRAs, presume-se que a ação deste gene deve influenciar a adesão mTECs-timócitos e indiretamente a apoptose dos timócitos (seleção negativa). Como este ponto é ainda elusivo, formulamos as seguintes hipóteses deste projeto: 1) A expressão do gene Aire influencia a adesão mTECs-timócitos e consequentemente a apoptose de timócitos, 2) Os microRNAs (miRNAs) controlam o processo de adesão mTECs-timócitos, 3) Os miRNAs controlam a expressão de TRAs, 4) Os miRNAs controlam a expressão do gene Aire. Nosso objetivo geral é estudar o controle transcricional de TRAs exercido por Aire em mTECs e também o controle pós-transcricional exercido por miRNAs e sua consequência na adesão mTECs-timócitos. Recentemente demonstramos que a linhagem de células murinas (M. musculus) mTEC 3.10 (MHCII+, CD80+) expressa em cultura o gene Aire e que esse gene controla, além de um grande conjunto de TRAs, muitos miRNAs. Além disso, essa linhagem é capaz de reproduzir in vitro a adesão mTECs-timócitos. Isso consolida o principal sistema modelo para testarmos essas hipóteses que é o ensaio de adesão mTECs-timócitos. Utilizaremos a técnica de silenciamento in vitro de Aire e da ribonuclease Dicer por meio de siRNA (anulação transitória) e também a seleção de células knockout (KO) por meio da transfecção com um vetor CompoZr-KO-Aire ou -Dicer (anulação permanente). Utilizando as células mTEC 3.10 manipuladas (siRNA/KO Aire e/ou Dicer) testaremos a participação de Aire e/ou de miRNAs no modelo de adesão in vitro. O transcriptoma (mRNAs) e o miRnoma (miRNAs) dessas células serão avaliados por meio de microarrays na tentativa de identificarmos genes de TRAs e/ou de moléculas de adesão celular envolvidos. O sequenciamento (next-generation sequencing) será utilizado para avaliar a expressão de isoformas de Aire e também das regiões 3´UTR de TRAs que poderiam anelar (ou não) com miRNAs. Finalmente, para confirmarmos a atuação de miRNAs sobre Aire, faremos uso do sistema modelo luciferase reporter assay com o qual testaremos a hibridização de miRNAs (preditos) na sequencia 3´UTR desse gene. Dessa forma, contribuiremos com melhor entendimento do controle transcricional e pós-transcricional que ocorre durante a adesão mTECs-timócitos, processo essencial para que ocorra a seleção negativa e indução da tolerância central. (AU)

Matéria(s) publicada(s) na Agência FAPESP sobre o auxílio:
Estudo avança compreensão de como surgem as doenças autoimunes  
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