Resumo
O objetivo desse projeto é identificar componentes da via de sinalização da insulina para captação de glicose e esteroidogênese de acordo com as variações cíclicas de 17²-estradiol (E2) no corpo lúteo (CL) cíclico e gestacional na espécie canina e cíclico na bovina, e nesta espécie resultante ou não de tratamentos com eCG. Para tal, no experimento (exp.) 1 serão utilizadas 16 vacas (Bos taurus taurus), as quais serão sincronizadas e metade delas tratadas com propilenoglicol para aumento da insulina circulante a partir de 72 h antes da aplicação de LH para ovulação. No exp. 2, novilhas taurinas serão sincronizadas e tratadas com 400 UI de eCG, 3 d após a ovulação. No exp. 1, as vacas terão os folículos aspirados para coleta de células da granulosa e em um outro ciclo, não ocorrerá aspiração folicular e os CLs de D6, D10 e D14 serão biopsiados. Este procedimento de biopsia luteal também será conduzido no exp. 2. A expressão gênica global será determinada através do sequenciamento de RNA (RNA-seq), a partir do qual serão selecionados genes diferencialmente expressos relacionados à via de sinalização da insulina para validação por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. No exp. 3, amostras de CL provenientes de vacas cíclicas, tratadas ou não com eCG e previamente analisadas por microarranjo, serão validadas para genes da via de sinalização insulínica da maneira já descrita acima. No exp. 4, 24 cadelas serão castradas na fase de diestro (dias 10 a 60 após a ovulação) e no exp. 5, 18 cadelas gestantes serão castradas nas fases inicial, intermediária e final da gestação. Os CLs serão coletados e também submetidos a RNA-seq e validações. Após obtenção dos resultados provenientes da análise gênica global, avaliaremos in vitro os efeitos da insulina em células luteínicas bovinas (exp. 6) e caninas (exp.7) cultivadas e submetidas a diferentes concentrações de E2. A verificação do papel funcional dos genes selecionados será realizada pela técnica de RNAi e as amostras de cultivo também submetidas ao RNA-seq e posterior validações. As análises de RNA-seq serão realizadas através do alinhamento das sequências geradas (reads) contra o genoma bovino e canino, respectivamente, as quais serão convertidas em transcritos, cujo nível de expressão será estimado através do índice RPKM (reads/Kb/Million). Os dados do sequenciamento serão publicados na biblioteca do NCBI (Sequence Read Arquives - SRA). Após as validações, os resultados obtidos serão testados, através do programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, EUA), de acordo com sua homogeneidade e normalidade e apresentados como média ± EPM. Diferenças de p d 0,05 serão consideradas significativas. Assim, a presente proposta pretende, além de desvendar o papel da insulina na função do CL, revisitar os mecanismos de regulação do CL nas duas espécies abordadas, uma vez que os experimentos de RNA-seq abrirão novas perspectivas de compreensão global deste fenômeno. (AU)
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