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Humanização do sistema de glicosilação de Pichia Pastoris pela técnica CRISPR-Cas9 visando a expressão de proteínas recombinantes terapêuticas

Processo: 15/25055-8
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de maio de 2016 - 31 de outubro de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Paulo Lee Ho
Beneficiário:Paulo Lee Ho
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Biologia sintética  Glicosilação  Pichia pastoris  Sistemas CRISPR-Cas  CRISPR-Cas9  Expressão de proteínas  Proteínas recombinantes 

Resumo

A produção de proteínas terapêuticas recombinantes representa uma das maiores atividades produtivas das indústrias na área de medicina molecular atual, compreendendo moléculas complexas e de alto valor agregado. Essas proteínas normalmente apresentam um padrão de glicosilação específico humano, sendo de grande importância no dobramento, estabilidade e atividade biológica da proteína. Visando reproduzir o padrão de glicosilação humano em leveduras, esse projeto visa o estabelecimento de uma linhagem de Pichia pastoris com um padrão específico de glicosilação humanizado por meio da deleção de dois genes envolvidos no sistema de glicosilação de leveduras, alg3 e och1, responsáveis pela posterior hiper-manosilação característica desse organismo. Dessa forma, é possível chegar a um intermediário comum à via de glicosilação humana. A edição do genoma de P. Pastoris será realizada por meio da técnica de edição de genomas CRISPR-Cas9, que revolucionou o campo da engenharia genética nos últimos dois anos. Esse sistema, pertencente ao sistema imune de procariotos e adaptado para edição de genomas em outros organismos, permite de forma bem simples a inserção e deleção gênica por meio de uma única enzima, Cas9, que realiza a clivagem da dupla fita de DNA guiada por um duplex de RNA. Para testar a eficiência desse novo sistema de glicosilação humanizado, a expressão da proteína glucocerebrosidase (GCR) recombinante foi proposta como modelo devido à sua importância e relevância econômica. A deficiência dessa enzima resulta em diferentes quadros da Doença de Gaucher, sendo alguns deles passíveis de tratamento por meio da terapia de reposição enzimática. A forma ativa de GCR recombinante usada na terapia apresenta resíduos expostos de manose no seu perfil de glicosilação, perfil este que espera ser reproduzido nas linhagens de P. pastoris com sistema de glicosilação humanizado. O sucesso no estabelecimento de um sistema de expressão de proteínas heterólogas com padrão de glicosilação humano permite a obtenção de uma plataforma nacional para produção de outras enzimas para terapia de reposição enzimática e outras proteínas terapêuticas de interesse biotecnológico, representando um projeto inicial de implantação de sistemas de edição genômica e biologia sintética no Instituto Butantan. (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
AKAMATSU, MILENA APETITO; SAKIHARA, VITOR ANSELMO; CARVALHO, BIANCA PEREIRA; ABRANTES, ALINE DE PAIVA; TAKANO, MARIA A. SAKAUCHI; ADAMI, EDUARDO ALFREDO; YONEHARA, FERNANDO SEIJI; CARNEIRO, PATRICIA DOS SANTOS; RICO, STEFANNI; SCHANOSKI, ALESSANDRA; MEROS, MAURICIO; SIMPSON, ADRIAN; PHAN, TONY; FOX, CHRISTOPHER B.; HO, PAULO LEE. Preparedness against pandemic influenza: Production of an oil-in-water emulsion adjuvant in Brazil. PLoS One, v. 15, n. 6 JUN 3 2020. Citações Web of Science: 0.
SOARES-SCHANOSKI, ALESSANDRA; BAPTISTA CRUZ, NATALIA; DE CASTRO-JORGE, LUIZA ANTUNES; HOMEM DE CARVALHO, RENAN VILLANOVA; DOS SANTOS, CLIOMAR ALVES; DA ROS, NANCY; OLIVEIRA, URSULA; COSTA, DANUZA DUARTE; SIMOES DOS SANTOS, CECILIA LUIZA; CUNHA, MARIELTON DOS PASSOS; SARNO OLIVEIRA, MARIA LEONOR; ALVES, JULIANA CARDOSO; DE LUCENA COUTO OCEA, REGINA ADALVA; RIBEIRO, DANIELLE RODRIGUES; AQUIME GONCALVES, ANDRE NICOLAU; GONZALEZ-DIAS, PATRICIA; SUHRBIER, ANDREAS; DE ANDRADE ZANOTTO, PAOLO MARINHO; DE AZEVEDO, INACIO JUNQUEIRA; ZAMBONI, DARIO S.; ALMEIDA, ROQUE PACHECO; HO, PAULO LEE; KALIL, JORGE; NISHIYAMA, MILTON YUTAKA; NAKAYA, HELDER I. Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus. PLOS PATHOGENS, v. 15, n. 6 JUN 2019. Citações Web of Science: 4.

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